نشكر تشون وانغ لبناء pTSO2 : GUS والصور في الشكل 1 ، ديتليف يجل لتقاسم بروتوكول GUS - مضمونة ، Sijacic Paja ، وكورتني Hollender للتعليقات مفيدة. ويدعم البحوث في المختبر Z. L ق من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (وIOB0616096 MCB0744752). معتمد جزئيا ZL من جامعة ميريلاند محطة التجربة الزراعية.

أولا الزهور وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يقرب من 1 الشهر قبل التحول ، وعلى زرع بذور Arabidopsis 4-8 القدور (5 الأواني بوصة مربعة) مع ما يقرب من 10-15 النباتات في وعاء. للنباتات ذات الخصوبة الطبيعية ، 4 والأواني من النباتات في بناء البلازميد يكون كافيا. إذا كان على المرء أن تحويل Arabidopsis متحولة مع انخفاض الخصوبة ، وزيادة عدد من الأواني وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع النباتات تحت ظروف قياسية (16 ساعة ضوء و 8 ساعة مظلمة عند 22 درجة مئوية). إذا تزرع النباتات تحت أقصر يوم أو انخفاض درجة الحرارة ، وسوف يستغرق وقتا أطول لزهرة وأطول لتكون جاهزة للتحول. حسن النية رعاية النباتات النباتات ضمان صحي ، وهما أمران أساسيان لتحقيق التحول الناجح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما انسحب النباتات عادل وبدأت زهرة. وهم الآن على استعداد للتحول. لزيادة كفاءة التحول ، 3-4 أيام قبل عملية التحول ، وتقليم قبالة براعم الإزهار الرئيسية في أقرب وقت لديهم لتشجيع تشكيل انسحب تبادل لاطلاق النار أكثر الثانوي. المياه والنباتات في اليوم قبل التحول. هذا يضمن أن التربة ولن امتصاص الكثير من وسائل الاعلام تسلل خلال غمس - نباتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يومين من التحول ، وتطعيم LB 40ml تحتوي على مضادات حيوية مناسبة (في حالة pTSO2 : : المكتب المركزي للاحصاءات ، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين) مع الأجرعية المورمة GV3101 سلالة تحمل pTSO2 : GUS بناء. غير المستنسخة في المكتب المركزي للاحصاءات التي تمتلك ناقلات pBIN20 NPTII الجين الذي يمنح مقاومة الكاناميسين 3 : pTSO2 :. تنمو بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز في 28-30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، 8ml نقل الثقافة بين عشية وضحاها إلى 400ml من LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين. تنمو بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز في 28-30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التحول ، عندما OD 600 من ثقافة الأجرعية تصل 0.8 تقريبا (600 OD بين 0.5 to1 مقبولة) ، وتدور باستمرار بين عشية وضحاها في الثقافة الأجرعية لمدة 8 دقائق في 5000rpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية الأجرعية في 1 لتر (لتر) من وسائل الاعلام التسلل (10MM MgCl 2 ، 5 ٪ سكروز ، 0.44mM 6 benzyladenine (BA) ، 0.3 ٪ silwet L - 77 ، 1X Gamborg ق فيتامين حل تعقيمها والمياه). وسيلة لا بد من تعقيمها لكنه يحتاج إلى بذل الطازجة. صب 1 المتوسطة L تسلل الأجرعية المحتوية على طبق (مثل 8 &quot;X15&quot; X2 &quot;طبق زجاج بيركس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس وعاء (النباتات لن تسقط) وتراجع جميع الأجزاء الهوائية من النباتات الى حل التسلل ، وعقد لمدة 5 دقائق وعاء واحد في وقت واحد. في حين تغمر جميع الأجزاء الهوائية من النبات في المتوسط ​​التسلل ، وتجنب ترك التربة امتصاص أي من وسائل الاعلام للحد من عمليات التسلل من فرص نمو الفطريات في التربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غمس ، ومكان كل الأواني انخفض الى جانبهم على عدة طبقات من منشفة ورقية في الدرج. والمناشف الورقية وتمتص كمية وصول وسائل الاعلام التسلل. غطاء علبة مع غلاف بلاستيكي لضمان ارتفاع نسبة الرطوبة. مكان الدرج في غرفة نمو النبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، إزالة التفاف البلاستيك والمناشف الورقية ، وأواني مكان في وضع مستقيم. لا مياه هذه المحطات لمدة أربعة إلى خمسة أيام. بعد ذلك ، والمحافظة على النباتات عادة حتى وضعوا بذور وجمع البذور بكميات كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب لوحات (150x15mm طبق بتري) مع MS المتوسطة يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (الوزن Murashige 2.2g الملح وسكوغ القاعدية دون فيتامين يذوب في 500 مل من الحموضة ، والمياه إلى 5.8 مع هيدروكسيد الصوديوم 1M ، إضافة 4 غرام آغار ، الأوتوكلاف ، باردة و إضافة إلى الكاناميسين 50 ميكروغرام / مل التركيز النهائي). وتحفظ لوحات في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد المقاومة للمضادات الحيوية للنباتات المعدلة وراثيا ، ويحتاج المرء إلى شاشة 20000 البذور في الحد الأدنى. 0.1 جرام من بذور حوالي 5000. وزن وتقدير كمية من البذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم البذور بغسلها في 15 مل أنبوب فالكون الايثانول مع 70 ٪ لمدة 30 ثانية. تغسل بماء معقم البذور مرة واحدة. نقع البذور لمدة 30 ثانية في محلول يحتوي على التخفيف من متجر 01:10 التبييض اشترى 5 ٪ (كلوروكس). شطف البذور مع الماء المعقم 3-6 مرات. في هود العقيمة ، انتشر نحو 5000 ماصة البذور على كل لوحة (الكاناميسين) MS ، بذور بالتساوي على لوحة ، وختم الشريط مع لوحات 3M Micropore لتجنب التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 3-4 أيام ، ثم نقل إلى غرفة لوحات (يمكن أن يكون نمو النبات نفس الغرفة). بعد حوالي 14 يوما والشتلات الخضراء المعدلة وراثيا ولكن يبقى منها غير المعدلة وراثيا هي تحول شاحبة ويموتون. نقل الشتلات المعدلة وراثيا في التربة عن طريق إبطاء سحب جذور الخروج من المتوسط ​​ووضعتها في التربة. </li></ol> II. دراسة pTSO2 : أنماط التعبير GUS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد pTSO2 : شتلات GUS المعدلة وراثيا ووضعها في البرد الأسيتون 90 ٪ في قارورة زجاجية أو أنابيب التلألؤ microfugeأن يتم الاحتفاظ على الجليد. ويمكن أيضا لوحات microtiter البوليسترين (لا البولي بروبلين) يمكن استخدامه إذا كان أحد بتحليل عدد كبير من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم حصاد جميع العينات ، ضع قارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. خلال هذا الوقت تشكل الطازجة العازلة دون تلطيخ X - الحلاوة (0.2 ٪ تريتون X - 100 ، 4 العازلة 50mM NaHPO pH7.2 ، 2mm والبوتاسيوم فيروسيانيد البوتاسيوم 2mm و، فيري سيانيد) ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأسيتون من العينات وإضافة العازلة تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الأشعة الحلاوة حل تلطيخ (0.2 ٪ تريتون س 100 ، 4 50mM NaHPO 2mm والبوتاسيوم الاحتياطي pH7.2 ، فيروسيانيد البوتاسيوم 2mm و، فيري سيانيد ، 2mm وX - الحلاوة). إزالة البقع من عينات عازلة وإضافة العازلة التي تحتوي على تلطيخ X - الحلاوة للعينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختراق العينات تحت فراغ لمدة 15 إلى 20 دقيقة. الافراج عن فراغ ببطء والتحقق من أن جميع العينات تغرق تحت سطح الحل تلطيخ. إذا لزم الأمر ، كرر تسلل حتى تغرق جميع العينات بعد إصدارها الفراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عينات في 37 درجة مئوية خلال الليل في المنطقة العازلة تلطيخ مع x - الحلاوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات من الحاضنة وإزالة البقع العازلة. غسل العينات في سلسلة متعاقبة من الإيثانول (20 ٪ ، 35 ٪ والايثانول 50 ٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة كل تغيير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة في تثبيتي FAA (الإيثانول 50 ٪ ، 5 ٪ فورمالدهايد وحامض الخليك 10 ٪ ، وبقية الماء) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة FAA وإضافة الإيثانول 70 ٪. عند هذه النقطة يمكن أن يكون تصور وتصوير الأنسجة تحت المجهر تشريح مجهزة بكاميرا رقمية. أما اللون الأزرق الداكن يدل حيث يتم التعبير عن TSO2 (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يمكن تخزينها في الأنسجة 4 درجات مئوية لمشاهدتها لاحقا. <img src="/files/ftp_upload/1952/1952fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 pTSO2 : : المكتب المركزي للاحصاءات في التعبير الشتلات المعدلة وراثيا (A) ، والجذور الجانبية (B) ، وقمة الجذر (C). علما بأن TSO2 المروج نشطة للغاية في الأنسجة الشباب والانقسام. نمط التعبير متفرقة هو موضح في (C) هو نموذجي من الجينات التي أعرب عنها في مراحل معينة دورة الخلية. </li></ol> ممثل النتائج عندما يوظف بشكل صحيح ، يجب أن تكون كفاءة التحول نحو 0،1-0،2 ٪. في كلمة أخرى ، ينبغي للمرء الحصول على الشتلات وراثيا عن طريق الفحص 5-10 كل بذور 5000. في المتوسط ​​، يمكن الحصول على حوالي 100 المعدلة وراثيا عن طريق تحويل خطوط 4 أحواض النباتات البرية من نوع. لشتلات المعدلة وراثيا تحتوي على pTSO2 : تم العثور على 3 GUS بناء ، واللون الأزرق الداكن يعكس GUS النشاط في خلايا نشطة بما في ذلك تقسيم يترك الشباب ، وقمة اطلاق النار ، وقمة الجذر ، والجذر الوحشي primordia (الشكل 1) : نمط غير موحدة متفرقة هو سمة من دورة الخلية مرحلة محددة التعبير.

<ol>
	<li>Clough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+agrobacterium-mediated+germ+line+transformation.">Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation.</a> Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).</li><li>Wang, C., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ribonucleotide+reductases+are+critical+for+cell+cycle+progression,+DNA+damage+repair,+and+plant+development.">Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development.</a> Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يتم تحديد كفاءة التحول العديد من العوامل المختلفة ، التي تناقش أدناه : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صحة النباتات وسنهم وذات أهمية قصوى. واحد تقريبا في الشهر إنتاج المصانع القديمة العديد من البراعم الزهرية غير ناضجة مثالية. وسوف يطلق النار على ال...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>6-benzyladenine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>852430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silwet-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crompton Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Toxic, wear gloves</td>
</tr>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg's vitamin solution 1000X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-glucuronide cyclohexamine salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biosynth</td>
<td>B-7300</td>
<td>Toxic, light sensitive keep in the dark</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropore 3M Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>19027761</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

floral-dip transformation of arabidopsis thaliana to examine ptso2::&beta;-glucuronidase reporter gene expression

القدرة على إدخال جينات أجنبية إلى كائن حي هو الأساس للبيولوجيا الحديثة والتكنولوجيا الحيوية. في النموذج النباتات المزهرة<em&gt; thaliana Arabidopsis</em&gt; ، والأزهار وتراجع التحول الأسلوب<sup&gt; 1-2</supاستبدلت&gt; جميع الطرق السابقة بسبب بساطته ، والكفاءة ، والتكلفة المنخفضة. على وجه التحديد ، ويطلق النار من الشباب المزهرة<em&gt; Arabidopsis</emوانخفض&gt; النباتات في حل<em&gt; الأجرعية المورمة</em&gt; تحمل يبني البلازميد محددة. بعد غمس ، يتم إرجاع النباتات للنمو الطبيعي وبذور المحصول ، ونسبة صغيرة منها تتحول مع الجين الأجنبية ويمكن اختيار لتحتوي على مضادات حيوية في المتوسط. هذا الأسلوب من الزهور وتراجع بشكل ملحوظ سهلت<em&gt; Arabidopsis</emساهم&gt; البحوث وإلى حد كبير في فهمنا وظيفة الجين المصنع. في هذه الدراسة ، ونحن نستخدم الزهور وتراجع طريقة لتحويل الجينات المراسل ،<em&gt; β غلوكورونيداز (GUS)</em&gt; ، تحت سيطرة<em&gt; TSO2</em&gt; المروج.<em&gt; TSO2</em&gt; الترميز لاختزال ريبونوكليوتيد (RNR) الوحيدات الصغيرة<sup&gt; 3</sup&gt; ، هو جين ينظم دورة الخلية الأساسية للdNDP الحيوي في المرحلة - S من دورة الخلية. فحص<em&gt; GUS</em&gt; التعبير في المعدلة وراثيا<em&gt; Arabidopsis</em&gt; تبين أن الشتلات<em&gt; TSO2</emوأعرب عن&gt; في تقسيم بنشاط الأنسجة. يمكن أن يكون الأسلوب التجريبي وذكرت ومواد تتكيف بسهولة ، ليس فقط للبحث ولكن أيضا من أجل التعليم في المدارس الثانوية والمستويات الجامعية.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::Î²-glucuronidase Reporter Gene Expression at JoVE.com

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

هذه المقالة يوضح الأزهار وتراجع طريقة<em&gt; الأجرعية المورمة</em&gt; بوساطة تحويل<em&gt; thaliana Arabidopsis</em&gt;. من خلال إدخال خلية تنظيم دورة المروج ، المراسل ،<em&gt; pTSO2 : β غلوكورونيداز (GUS)</em&gt; ، في<em&gt; Arabidopsis</em&gt; ، ونحن يوضح كيف يمكن للمرء التعبير الصحفي بالكشف عن GUS في الشتلات وراثيا.

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

floral-dip-transformation-arabidopsis-thaliana-to-examine-ptso2

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

35.8K Views.  University of Maryland College Park. هذه المقالة يوضح الأزهار وتراجع طريقة الأجرعية المورمة بوساطة تحويل thaliana Arabidopsis. من خلال إدخال خلية تنظيم دورة المروج ، المراسل ، pTSO2 : β غلوكورونيداز (GUS) ، في Arabidopsis ، ونحن يوضح كيف يمكن للمرء التعبير الصحفي بالكشف عن GUS في الشتلات ...

Video: Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

تلطيخ النسيجية من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الخليوي الثانوية ستريت عناصر

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

الأزهار وتراجع التحول من الكتان (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) لتوليد المعدلة وراثيا السلالات مع معدل التحويل عالية

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

التحقيق الزماني المكاني لديناميكيات ERL1 عبر التصوير البؤري

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

تسليط الضوء على المؤلف: الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...