对于小鼠小肠隐窝分离，使用正确洗涤的5毫米乘5毫米的分离鼠小肠碎片。将碎片在含有两毫摩尔EDTA的PBS抗生素中在冰上孵育30分钟，不要摇晃。为了缓解细胞外基质或ECM的凝固，事先在37摄氏度的组织培养箱中孵育24孔板。
从组织碎片中吸出EDTA溶液后，加入25毫升新鲜的冷PBS抗生素。然后用手用力摇晃容器，30 到 40 次。通过70微米过滤器过滤悬浮液一次。
在继续下一步之前，请确认显微镜下是否存在隐窝。接下来，将悬浮液在 390 G 和 4 摄氏度下离心三分钟。然后，将隐窝颗粒重新悬浮在含有2%山梨糖醇的20毫升DMEM中，以下称为山梨糖醇DMEM。
将10毫升的隐窝悬浮液转移到两个新的15毫升管中的每一个。这一次，在4摄氏度下以80G的较低速度离心两个试管三分钟，以将大细胞团与细胞或碎片分离。轻轻吸出上清液，在每个管中留下约两毫升上清液。
然后，向每个试管中加入10毫升山梨醇DMEM。再次在 80 G 和 4 摄氏度下离心悬浮液三分钟。如前所述吸出上清液，并加入10毫升山梨醇DMEM进行重悬。
吸出上清液后，加入10毫升完全DMEM，并通过上下移液重新悬浮沉淀。让悬浮液静置一分钟，以有效地获得浮动地穴。一分钟后，通过70微米细胞过滤器将两个管中的悬浮液过滤到新管中以纯化隐窝。
为了在播种前计算纯隐窝，将 25 微升液滴入三个点的 6 厘米培养皿中。在显微镜下以4X放大倍率计算隐窝的数量，并计算每25微升的隐窝浓度。然后，将整个滤液在290 G下在4摄氏度下离心三分钟。
对于接种，将隐窝悬浮在ECM中，浓度为每40微升ECM100个隐窝。轻轻地上下移液 5 到 10 次，避免气泡以获得均匀的悬浮液。然后，在预热的24孔板中每孔接种40微升的隐窝悬浮液。
将24孔板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育15分钟，以聚合ECM。用含有小鼠表皮生长因子，重组小鼠R-Spondin 1和重组小鼠noggin的500微升培养基覆盖每孔的ECM。此处显示了每孔材料的最终浓度。
通过在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育来培养隐窝。使用延时图像显微镜每三小时进行一次实时成像以记录类器官形态发生，持续长达七天，并获得连续 Z 堆叠图像。几乎所有孤立的隐窝都立即被密封，一旦从上皮壁龛中挤出来，就会呈现出锥形。
此外，最终部分的隐窝被整合并适合用于培养。类器官生长的延时图像显示，肠道干细胞的活跃增殖和分化发生在出芽的隐窝区域。出芽与细胞迁移、增殖和潘氏细胞分化相结合。
