Assessing the Effects of Lipofuscin-Like Granules on RPE Phagocytosis: Total Consumptive Capacity

首先，计算实验所需的孔数。然后，解冻适量的常规操作系统样本。添加足够的 RPE 培养基，使最终 OS 浓度达到每毫升 10 的四倍到六分之一。

除去顶端培养基，用适当浓度的桥接配体向每毫升第六个OS加入50微升四乘以10。添加操作系统后，将样品孵育在不同的时间点。在孵育结束时，加入16.67微升四倍Laemmli样品缓冲液和蛋白酶抑制剂，以裂解细胞和含有上清液的上层OS。

使用P200移液器划伤Transwell表面并将合并的细胞上清液和细胞裂解物收集在一起。涡旋并在室温下放置 30 分钟以彻底变性。视紫红质的蛋白质印迹显示，完整的视紫红质条带在对照和UAM负载RPE细胞中难以区分。

然而，UAM组中视紫红质的切割产物较高，表明吞噬溶酶体系统存在一些轻度降解功能障碍。GAPDH水平相等表明孔之间的细胞计数相等。不同的视紫红质抗体可识别不同的降解片段。

4D2识别视紫红质的末端，直到溶酶体降解的最后步骤都是完整的。相反，1D4识别视紫红质的C末端，视紫红质在吞噬溶酶体过程中早期降解。