首先，将同步的年轻成年秀丽隐杆线虫雌雄同体放入微型离心管中。向蠕虫沉淀中加入 200 微升含有泊洛沙姆 188、Pluronic F127 和 2 微升染色试剂盒试剂的 M9 缓冲液。用铝箔覆盖管子以保护染料免受光照。
让混合物在室温下以 20 RPM 旋转一小时。然后以 500 G 的速度旋转蠕虫一分钟。之后，在不干扰蠕虫颗粒的情况下去除染色溶液。
用M9缓冲液洗涤蠕虫三次，并将它们转移到含有适当处理的种子NGM琼脂平板中。将盘子上的蠕虫洗到带有一毫升M9缓冲液的新鲜微量离心管中。之后，用1%甲醛将蠕虫固定在冰上30分钟。
并用一毫升M9缓冲液清洗蠕虫三次，以去除任何残留的甲醛。沉淀蠕虫后，吸出最大量的上清液，使沉淀在10微升M9中保持完整。接下来，制备2.5%琼脂糖，称取0.125克琼脂糖到10毫升硼硅酸盐玻璃试管中。加入五毫升M9缓冲液，用本生燃烧器轻轻加热管子溶解琼脂糖。
将融化的琼脂糖转移到75摄氏度的干浴中。使用一毫升尖端将100微升融化的琼脂糖添加到甲板光泽显微镜盖玻片上。立即，将另一张载玻片垂直放在琼脂糖滴上，形成十字形。
两分钟后，通过推动上盖玻片轻轻分开载玻片，将琼脂糖垫留在底盖载玻片上。用巴斯德玻璃移液管将蠕虫转移到琼脂糖垫上。使用由实验室湿巾制成的灯芯去除多余的液体。
然后用较小的盖玻片盖住蠕虫，并在外围涂上透明的指甲油以防止蒸发。将载玻片放在暗盒中以保护其免受光照。使用共聚焦显微镜在24小时内使用60倍放大镜以适当的波长对蠕虫进行成像。
接下来，打开成像软件并右键单击灰色区域。从显示的弹出窗口中，选择获取。Ti2 全垫。
ND 采集和查找表。在Ti2全垫下，选择60次并调整显微镜精细聚焦旋钮以使蠕虫聚焦。然后选择旋转光盘并选择 16 位无合并选项。
对于每个荧光滤光片，将曝光时间设置为500毫秒，明场设置为20毫秒。设置这些参数后，选择立即运行并等待输出图像生成为 ND2 文件。
