Crude Mitochondrial Fraction Preparation

首先从含有贴壁原始264.7的平板中吸出培养基。每 15 厘米板添加 10 毫升 PBS。使用细胞刮刀分离细胞并将它们拉入单个 50 毫升管中。

上下移液细胞悬液以均质化。接下来，将5%的细胞悬液体积转移到新的1.5毫升管中。在室温下以300G离心五分钟。

弃去上清液并将总细胞级分沉淀放在冰上。如前所述离心剩余的悬浮液后，吸出上清液并将细胞沉淀重新悬浮在五毫升冰冷的线粒体缓冲液中。在 300G 下在 4 摄氏度下离心悬浮液五分钟。

将沉淀重新悬浮在0.5毫升冷线粒体缓冲液中。并将悬浮液转移到1.5毫升管中。接下来，使悬浮液均质化，通过安装在一毫升注射器的 25 号针头绕过它 30 次。

然后将一毫升冷线粒体缓冲液加入试管中并通过倒置混合。离心细胞后，将一毫升上清液转移到冰上的新管中。将沉淀重新悬浮在缓冲液中，并通过安装在一毫升注射器上的 25 号针头使沉淀均质化。

将先前步骤中的匀浆细胞沉淀和上清液拉入单个1.5毫升管中。在 2， 000G 的温度下在 4 摄氏度下离心五分钟。收集上清液并将其分成四个1.5毫升管。

使用线粒体缓冲液将每个管中的体积补足至1.5毫升。倒置试管以混合其内容物，然后离心试管。小心地除去上清液和上部白色细胞沉淀。

将含有棕色线粒体颗粒的四个试管中的一个作为粗线粒体部分保存在冰上。将剩余的颗粒拉入新管中，并用线粒体缓冲液使最终体积为一毫升。使用该协议，从原始264.7巨噬细胞系和BMDM中获得总细胞和粗线粒体部分。

免疫血液分析表明，线粒体柠檬酸合酶在粗馏分中富集。来自细胞质、质膜、细胞核、溶酶体和内质网的蛋白质消失了。蛋白质组分析显示，粗馏分的富集量增加了十倍以上。

其他六个细胞区室在纯化过程中耗尽。