该程序的总体目标是从人类细胞系的线粒体中大规模地纯化核糖体，这足以进行结构研究。这种线粒体核糖体纯化方法能够对复变物、突变体、质量控制总成和三体体子基中间体进行表征。这些可用于回答有关线粒体中蛋白质合成的关键问题。
该技术的主要优点是，氮气穴用于细胞解，只需要10至10个培养细胞来准备三体体，以便进行高分辨率结构测定。该技术可发现线粒体翻译机制的新成分，并可进一步用于开发用于癌症治疗的新疗法。根据文本协议培养 HEK293S 细胞后，在 1000 倍 g 和 4 摄氏度的离心下收获两根 1 升的细胞管，为期 7 分钟。
小心地将上一液液，并迅速将每个颗粒重新在 100 毫升 PBS 中重新下水。然后，将电池集中，将悬浮液在1200倍g和4摄氏度下离心10分钟。接下来，在仔细抽取上经剂后，称量颗粒。
然后，使用120毫升的MIB缓冲液重新暂停，让重新暂停的细胞在冷室膨胀20分钟。将膨胀的细胞转移到冰上预冷的氮气穴室。然后，向细胞中加入45毫升的SM4缓冲液。
紧固氮气穴，并加注氮气，直到压力达到 500 PSI。然后，关闭水龙头，并在冰上保持20分钟。氮气穴细胞解解法可防止细胞外在物理压力，避免对细胞器的热损伤，氮气保护细胞免受氧化。
此外，它是一种高度可重复的方法。慢慢释放腔室中的压力并收集酸盐。然后，要去除细胞碎片和核，在800倍g和4摄氏度下将碎化材料离心10分钟。
通过将上经液倒入冰上的烧杯中，将其通过折叠的一块粘布收集。不要丢弃颗粒。将颗粒重新在 90 毫升的 MiBSM 缓冲液中。
然后，使用特氟隆玻璃向下均质器，使样品均质，并在 800 倍 g 和 4 摄氏度下重复离心 10 分钟。再次，通过将上经液通过折叠的一块粘布倒入冰上的烧杯中来收集上一道。然后，将此上一时分与第一个上一个上一个样液结合使用。
将样品以1000倍的g和4摄氏度离心15分钟。然后，收集上一点，像以前一样。丢弃颗粒后，将含有粗线粒的上经剂在10，000倍g和4摄氏度下离心15分钟。
小心地洗掉任何松动的颗粒，而不干扰紧绷的部分。然后，使用10毫升的MiBSM缓冲液重新暂停紧颗粒。将 200 单位的无 RNase DNase 添加到样品中，取出基因组 DNA，并在冷室的滚筒上旋转管 20 分钟，以均匀消化样品。
将样品在10，000倍g和4摄氏度下离心15分钟，并使用两毫升SEM缓冲液重新填充颗粒。将整个线粒体悬浮液加载到蔗糖梯度上。根据文本协议旋转梯度后，使用转移移液器，在32%和60%蔗糖的界面上仔细收集棕色带迁移。
该协议使用氮气穴来破坏细胞。一旦掌握，高度纯净，完整的线粒体的大规模隔离可以在9小时内完成，可以很容易地修改和适应不同的细胞类型和规模。在冰上解冻冷冻线粒体后，在三毫升线粒体中加入两卷解液缓冲液。
立即混合通过反转管几次。使用小特氟隆玻璃向下均质器，以帮助解解和孵化冰上的均质质5至10分钟，以完成反应。将溶酸在30，000倍g和4摄氏度下离心20分钟，以去除不溶性物质。
然后，仔细收集上一液并丢弃颗粒。重复离心，以确保澄清上一点。然后，仔细收集上一液并丢弃颗粒。
对于每毫升的开水材料，在 TLA-120.2 超透明管中准备蔗糖垫，向管中加入 0.4 毫升蔗糖垫。将大约一毫升的线粒体层对每个蔗糖垫，导致 2.5 比 1 的落盐与垫比。然后，将样品在 TLA-120.2 转子中离心，温度为 231、550 倍 g 和 4 摄氏度，45 分钟。
丢弃上清液，使用100微升的再增液液冲洗管并去除残留蔗糖。重新填充颗粒，并将它们组合在总共100微升的再增缓冲液中。在重新填充缓冲颗粒时，必须进行冰上操作，以避免样品加热，并避免样品发泡，以确保线粒体核糖体的结构完整性。
以慢速旋转样品30秒，溶解剩余的集料，并在17，949倍g和4摄氏度下将管离心10分钟。小心地收集上一液，并重复离心。在 A260 测量三分之一体吸收后，将整个样品加载到单个线性蔗糖梯度管上。
将样品在 TLS-55 转子中以 213、626 倍 g 和 4 摄氏度离心 120 分钟。要对梯度进行分馏，请刺穿管的底部，并在 96 井板中采集样品。对于足够数量的三足体体，三足体净化不应超过七小时。
正如这种不连续的蔗糖梯度所证明的，纯化线粒体在32-60%界面上迁移到棕色下带。在蔗糖梯度上从可溶性线粒体分离出三体体后，确定了两个主要的三体，单体55S和大亚单位39S。大亚单位分数的存在表明细胞在主动分裂状态下收获。
此面板显示一个微图，其中样本来自单体峰值二，校准放大倍数为每像素 1.23 个焦虑。此处显示的数据是初始处理后显示完整的单体。最后，本面板将说明单体 3D 重建。
看完这段视频后，你应该对如何为结构和生化研究准备完整的人类三体有好的认识。我们的协议提供高质量的最终准备，可以外推到其他线粒体大分子。
