Post-Expansion Biomolecule Profiling of the Digested and Expanded Tissue

首先，取消化和扩增的存档或新鲜临床组织样品，并将其置于六孔细胞培养板的单孔中进行抗体染色。用PBS洗涤样品三次，每次在室温下洗涤10分钟。根据样品大小，在染色缓冲液中加入0.5至2毫升一抗，以充分覆盖凝胶。

在 37 摄氏度下孵育过夜。然后，在室温下用PBS洗涤样品三次，每次10分钟。加入相应的二抗，并在所选的染色缓冲液中以37摄氏度孵育3小时。

如前所述重新洗涤样品，并在六孔板中向样品中加入1至2毫升聚乙二醇。在室温下用Fluor 4偶联NHS酯对样品染色三小时。在孵育结束时，用PBS洗涤样品三次。

接下来，为了进行脂质染色，取在PBS中洗涤三次的膨胀组织样品，在2毫升0.1%Triton X-100或PBS中稀释200倍的常规亲脂性染料在室温下72至96小时，并用PBS洗涤至少三次。为了进行FISH，通过混合2 x SSC，10%葡聚糖硫酸盐，20%碳酸乙烯酯和0.1%吐温20来制备杂交缓冲液。将匀浆凝胶样品置于60摄氏度预热的杂交缓冲液中30分钟。

然后，将凝胶样品与含有10皮摩尔FISH探针的杂交缓冲液在45摄氏度下孵育过夜。用严格的洗涤缓冲液洗涤样品两次，每次 45 摄氏度下 15 分钟，在 37 摄氏度下洗涤两次，每次 10 分钟。用PBS洗涤样品3次10分钟，然后继续成像或将样品储存在PBS加0.02%叠氮化钠中，温度为4摄氏度。

为了完全扩增和成像组织，将PBS中扩增四倍的样品移动到玻璃底六孔成像板上。如果样品已进一步扩展，请将其切成小块。将0.1%聚赖氨酸涂在玻璃表面。

将样品放在载玻片上，并用实验室纸布去除凝胶周围的任何多余液体，以防止凝胶在成像过程中移动。然后，使用传统的宽视场显微镜、共聚焦显微镜或其他选择的成像系统进行荧光成像。成像后，将样品在PBS中收缩至少三次10分钟的洗涤，因为长期储存在去离子水中会导致荧光信号降解。

最后，将样品储存在含有0.02%叠氮化钠的PBS中，温度为4摄氏度。完全扩增的小鼠脑组织的共聚焦图像允许蛋白质以及细胞和线粒体膜结构的可视化。还鉴定了正式和固定石蜡包埋的人淋巴结组织的核酸。

肾切片扩张3.5倍后，可见无裂缝扩张的肾小球。然而，锚定或均质化不足导致开裂、变形和另一个肾脏切片中标记靶标的丢失。