Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal-Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity

首先，取hBM-MSCs和GFP-HUVECs共培养，每孔用200微升PBS洗涤一次。加入 BCIP/NBT 底物溶液，并在 37 摄氏度下孵育培养物，同时定期监测显色。一旦颜色在非成骨条件下发展，立即用每孔200微升PBS洗涤。

将样品固定在4%多聚甲醛中后，获取染色样品的彩色图像。为了量化细胞裂解物中的ALP活性，每孔加入200微升0.25%胰蛋白酶-EDTA到用PBS洗涤的培养物中，并在37摄氏度下孵育。通过上下剧烈移液每10分钟搅拌一次培养物以促进消化，并用标准细胞培养显微镜监测培养物形态。

然后将样品转移到2毫升管中，并加入200微升间充质干细胞基础培养基以抑制胰蛋白酶。离心并丢弃上清液后，将沉淀冷冻在80摄氏度或直接进行下一步。解冻细胞沉淀，加入500微升裂解缓冲液，在冰上孵育30分钟。

接下来在 16， 100 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟，并将样品保持在冰上。在不干扰任何沉淀碎片的情况下，将50微升上清液一式两份分配到透明组织培养96孔板的每个孔中。将50微升制备的碱性磷酸酶试剂加入96孔组织培养板的孔中。

短暂摇动板，并在 37 摄氏度下避光孵育 10 分钟。通过使用多通道移液器加入100微升1摩尔氢氧化钠来停止反应。使用酶标仪读取410纳米处的光密度。

对于DNA定量，解冻冷冻样品，离心，然后将它们放在冰上。在不干扰任何沉淀碎片的情况下，将50微升细胞裂解物上清液一式两份分配到黑色96孔板的孔中。添加一式两份的DNA标准品。

接下来，使用多通道移液器加入50微升DNA染色剂，然后根据制造商的说明孵育并读取荧光强度。利用标准曲线值来确定并将测量的强度值转换为DNA浓度。最后，通过将碱性磷酸酶值除以每个样品的相应DNA浓度来标准化碱性磷酸酶值。

定量碱性磷酸酶活性以表征培养物的成骨潜力表明，标准化的碱性磷酸酶活性在不同条件下变化很大，随着BMP-2浓度的升高和100纳克/毫升的平台，活性呈增加趋势。对于含有每毫升50纳克FGF-2的病症，确定了最低的活性水平。与FGF-2相比，在BMP-2存在下观察到更广泛和强烈的紫色染色。