在含有腺相关 ITR 的质粒中克隆目的基因后，使用补充有 10% FBS 的预热 DMEM 将 10 次接种到 5 个细胞中 3 次到六孔板中。让细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下生长，以达到 75% 至 90% 的汇合度。接下来，将 100 毫克聚乙烯亚胺盐酸盐或 PEI max 溶解在 100 毫升蒸馏水中，制成每微升 1 微克的原液。
使用氢氧化钠将pH调节至7.1。然后使用 0.22 微米过滤器对混合物进行灭菌，并将试剂在 4 摄氏度下储存一个月。在 2 毫升试管中，向无血清 DMEM 中加入 1.3 μg rep/cap 质粒、1.3 μg 含有 ITR 的质粒和 2.6 μg 腺病毒辅助质粒。
该混合物的总体积应为100微升。在单独的试管中制备阴性对照，用不相关的质粒替换rep/cap质粒。现在向质粒混合物中加入 5.2 微升 PEI max。
这保持了相等的质粒与PEI的比率。在设置为 7 的涡旋混合器上轻轻涡旋 10 到 15 次。对于多个载体，在后续步骤中以一分钟的间隔错开 PEI 添加，以获得足够的时间。
在室温下孵育每个试管正好 15 分钟。然后通过加入 1.9 毫升无血清 DMEM 稀释反应，以达到 2 毫升的最终体积。轻轻移液两次以混合内容物。
从孔中吸出培养基。小心地将质粒PEI混合物添加到孔的侧面，以避免细胞分离，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育细胞72小时。然后将转染细胞板在零下 80 摄氏度下冷冻 30 分钟，并在 37 摄氏度下解冻 30 分钟。
重复该循环总共三次。在层流罩中，通过移液无菌混合每个孔，以有效破坏细胞。将裂解物转移到两毫升管中。
在室温下以 15， 000 G 离心 15 分钟以除去细胞碎片，然后小心地将上清液转移到新的 2 毫升管中，并将管储存在 4 摄氏度。接下来，将所需的细胞类型铺在 96 孔板中，并孵育目标汇合度为 50% 至 75%，具体取决于转导持续时间。第二天，在无血清培养基中对粗制剂进行一至三次稀释系列，以获得转导所需的最佳载体量。
然后从 96 孔板中吸出培养基，并向孔中加入 50 至 100 微升稀释的粗制剂。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。为了确定转导效率，在转导后48小时使用荧光显微镜观察荧光报告基因的表达。
为了进一步分析，取出载体并用预热的PBS洗涤细胞一次。最后，通过将细胞固定在 4% 多聚甲醛中 10 分钟来终止转导。转导效率数据表明，AAV2 和 KP1 是所有测试细胞系中最有效的血清型。
与 Huh7 相比，HEPA1-6 的转导显著降低。AAV2 有效转导未分化的 HSKMC 成肌细胞和分化的 HSKMC 肌管。不同的培养基条件在转导过程中起着重要作用。
与在类器官生长培养基中培养的小鼠小肠类器官相比，在预转导培养基中培养的小鼠小肠类器官的转导效率较低。
