组织样本中中性粒细胞胞外陷阱的免疫荧光染色

首先将一滴含有驴血清的即用型封闭溶液移液到组织样本上。然后将样品在室温下孵育 30 分钟。将边缘敲击在坚硬的表面上，从载玻片上去除多余的阻塞溶液。

稀释抗体稀释缓冲液中的一抗，为每个样品制备 100 微升最终溶液。设置抗体，每个一抗一个管，每个同对抗体一个管。将 100 μL 的 isocontrol 抗体均匀涂抹到一个样品中，将 100 μL 的髓过氧化物酶和瓜氨酸化组蛋白 H3 或髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶抗体稀释到另一个样品中。

将载玻片放入潮湿的腔室中，并在 4 摄氏度下存放过夜。第二天，从载玻片中取出多余的一抗溶液，并将它们堆叠在比色皿中。使用带有补间的Tris缓冲盐水冲洗载玻片三次，每次五分钟，以除去剩余的一抗溶液。

制备两种明显的荧光二抗，驴抗山羊的髓过氧化物酶和驴抗兔的瓜氨酸组蛋白 H3 染色。在抗体稀释缓冲液中将每种抗体稀释至每毫升 7.5 微克浓度。将载玻片置于湿室中，并将 100 微升二抗溶液分配到每个样品上。

在室温下避光孵育 30 分钟。通过敲击载玻片去除多余的二抗溶液。将载玻片放入载玻片架中。

将载玻片浸没 3 次，每次 5 分钟，放入装有 PBS 的染色罐中，以洗去未结合的抗体。准备滴状溶液并用去离子水稀释至每毫升一微克的浓度。将载玻片架浸入含有 dappy 溶液的染色罐中，并在室温下在黑暗中孵育 5 分钟。

接下来，将载玻片架浸入装有 PBS 的染色罐中五分钟，以洗掉任何多余的滴状溶液。最后，使用盖玻片和封片介质封片样品。瓜氨酸组蛋白 H3 抗体仅与细胞外组蛋白结合，未显示细胞内组蛋白染色。

人或小鼠特异性髓过氧化物酶抗体未显示特异性染色。而通用的人和小鼠抗体对髓过氧化物酶的染色一致良好。当不使用封闭剂时，一些小鼠样本显示出更多的非特异性和部分阳性染色。

当被阻止时，与 10 分钟的阻止时间相比，5 分钟的阻止时间显示出良好的效果。微波和水浴中的较高温度显示出持续的中度至良好抗原修复。而在 60 摄氏度的水浴中，只有部分阳性或没有染色。

对于双重染色，在96°C水浴下孵育的样品获得了更有利的结果。然而，在 96 摄氏度下超过 40 分钟的孵育时间会导致抗体染色强度降低。