Image Processing of REP Deposits, Segmentation, and Quantification

使用共聚焦显微镜和 40X 物镜，为所用脂质标记物创建具有适当荧光通道的扫描曲线。设置采集模式和通道后，单击软件自动对焦优化对焦策略。然后将 Z Stack 的范围设置为 20 微米。

在此之后，优化磁贴并打开查看器以选择磁贴位置。接下来，使用批处理图像处理方法，使用扩展焦深方法创建每个 Z 堆栈的最大投影。在导出图像之前，请将压缩设置为无，并确保检查原始数据。

得到的图像是仅荧光通道的最大投影灰度TIFF，表示脂质标记物。识别表示 Nile Red、BODIPY 或 APOE 的 TIFF 图像，并将它们移动到名为 Nile Red、BODIPY 或 APOE 的目录中的 Images 文件夹中，具体取决于所使用的方法。打开脂质单位软件。

在“预测”选项卡中，通过单击省略号并导航到命名目录来选择相关目录。通过检查类条目确认脂质单位已正确识别图像。单击“预测”以观察任务进度，然后使用“掩模分析”工具遍历生成的掩模，并提供掩模图像中阈值脂质沉积的定量计数。

RPE的成功分化和成熟显示出具有色素沉着和多边形形态的汇合单层。相反，不成功的分化显示垂死的细胞簇。在荧光图像中，尼罗河红和BODIPY沉积物表现为小而明亮的圆形点。

阴性结果显示不正确的图像分割，将背景荧光误认为是沉积物，这是由于染色较弱或背景强度高所致。图中显示了大小、形状和信号强度各不相同的 APOE 沉积物，需要优化染色和成像方法以尽量减少变化。