首先在第七个培养日从iPSC细胞悬液中去除II期培养基。现在用两毫升DPBS洗涤细胞。向每个孔中吸取一毫升细胞分离溶液。
然后将板放入 37 度的培养箱中五分钟。孵育后,向细胞中加入一毫升II期培养基并充分混合,直到细胞从表面分离。将细胞悬液收集在 15 毫升管中,然后在室温下以 400g 离心 3 分钟。
离心后,弃去上清液,将细胞沉淀重悬于两毫升III期培养基中。轻轻混合溶液。现在将悬浮液以 1 比 3 的比例接种到六孔低粘附板中。
将板放在轨道振荡器上,放在37摄氏度的培养箱中,用5%二氧化碳。要去除悬浮培养物中的培养基,首先使用无菌剪刀剪掉一毫升移液管的尖端。然后轻轻搅拌六孔板以集中类器官。
接下来,用准备好的移液器吸出类器官,并将它们放入 15 毫升的试管中,让它们静置五分钟。吸出上清液,确保类器官保留在试管底部。然后将III级培养基移液到板中。
移液管混合物以重悬类器官。将类器官重新铺板到六孔低粘附板中。在培养箱中以每分钟60转的速度继续摇动低粘附板。
第12天,用IV期培养基代替培养基。肾脏类器官呈管状结构,聚集 18 天后很容易在明场图像中观察到。诱导CD31内皮细胞。
右旋糖酐被带入肾脏类器官的近端小管中。