Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography

要开始准备用于细胞冷冻断层扫描的电子显微镜网格，请将装有穿孔碳支撑膜的网格放置在辉光放电装置中，网格的碳面朝上。然后，在 15 毫巴大气压下，以 0.39 毫安的电流对电网进行辉光放电 45 秒。完成后，将网格放入干净的容器中，内衬滤纸。

接下来，将网格与纤连蛋白、磷酸盐缓冲盐水或 PBS、板和镊子一起转移到生物安全柜中。使用微量移液器，将两个大尺寸的牛纤连蛋白点投射到无菌表面（如六孔板盖）上。确保点足够大以包围整个网格。

然后，获得 5 x 15 镊子，并用纤连蛋白粘附液处理网格的两侧。一旦用牛纤连蛋白处理，网格就会变得粘稠。在六孔板中将网格的非碳表面轻轻触摸到空孔的底部，然后松开镊子将网格连接到新表面上。

接下来，将网格在纤连蛋白粘附液中孵育 30 分钟。为防止网格干燥，每 15 分钟使用微量移液管在网格顶部添加一到两滴粘附溶液。孵育后，用微量移液管除去过量的粘附溶液。

使用微量移液器直接在网格顶部添加PBS滴两到三次来清洗网格。在生物安全柜中，在紫外线下对网格进行消毒一小时。将网格放置在尽可能靠近紫外线的位置，以实现最大程度的灭菌。

通过每 10 分钟在网格顶部微量移液一到两滴 PBS，防止网格在灭菌过程中干燥。