Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

在对含有细胞的电子显微镜网格进行深度冷冻之前，在倒置光学显微镜下检查网格。记录每个网格上的细胞密度，以调整浸入冷冻期间的印迹时间。在 37 摄氏度的空板中加热 2 至 3 毫升磷酸盐缓冲盐水或 PBS。

对于金基准点制备，将 50 微升 10 纳米胶体金珠溶液移液到干净的 1.5 毫升管中。向其中加入两微升牛血清白蛋白，并通过反复微量移液匀浆。将试管以 15， 000 至 20， 000 G 离心 15 分钟。

小心地除去上清液，不要使用微量移液管干扰沉淀。如前所述，将沉淀重新悬浮在50微升PBS中，并再次离心管。使用 10 微升吸头吸出 4 微升沉淀，并将其转移到干净的 1.5 毫升管中。

将环境室设置在 95% 湿度和 30 摄氏度。使用 5 x 15 镊子，选择一个网格并用 PBS 清洗。将清洗过的网格转移到插入镊子上。

固定网格后，取出 5 x 15 镊子并滑动 clamp 在插入镊子上。将网格插入插入冷冻机，同时保持夹子牢固。在网格的背面添加一微升的金基准点。

然后将两到三微升的 PBS 添加到网格的碳侧。在浸入冷冻液态乙烷之前，利用自动印迹法对网格的背面进行印迹。转染 U2OS 细胞的冷冻相关光学和电子显微镜图像显示存在产生 HIV 的细胞。

电子冷冻断层扫描图像显示多个HIV颗粒从U2OS细胞的质膜中萌芽。