Agrobacterium-Mediated Transformation of Chlorella vulgaris and Confirmation of Gene Integration via Colony PCR (CPCR)

首先移出 0.5 毫升寻常小球藻的对数期培养物。将培养物铺在Tris-乙酸盐-磷酸盐或TAP琼脂平板上。在 25 摄氏度下培养培养 5 天。

接下来，在摇瓶中接种 10 毫升补充的 LB 肉汤，其中装满电穿孔根癌农杆菌培养物的环。将烧瓶在 28 至 30 摄氏度和 250 RPM 下孵育过夜。第二天，将 1 毫升过夜培养物接种到 50 毫升补充的 LB 中。将烧瓶在 28 至 30 摄氏度和 250 RPM 下孵育。

共同培养藻类和细菌培养物。首先，将农杆菌培养物转移到 50 毫升管中。在室温下以 4， 000 G 离心管 30 分钟。

然后，用移液取出上清液将其丢弃，并使用诱导培养基洗涤细胞两次。接下来，将 25 毫升诱导培养基加入小球藻培养板上。将细胞转移到 50 毫升管中，然后在室温下以 4， 000 G 离心 15 分钟。

处理上清液后，将藻类细胞沉淀与200微升细菌悬浮液混合。在21至25摄氏度的旋转培养箱中摇动合并的培养物，以150 RPM的速度摇晃一小时。将 200 微升混合培养物铺在诱导培养基板上，补充 15 毫摩尔葡萄糖，并将板在 21 至 25 摄氏度的黑暗中孵育三天。

三天后，使用 10 毫升 TAP 培养基将微藻收集到烧瓶中。补充每升 20 毫克四环素。将烧瓶在黑暗中孵育两天，温度保持在 21 至 25 摄氏度之间。

将 500 微升培养物铺在每升补充有 20 毫克四环素的选择性培养基上。将板在 21 至 25 摄氏度的黑暗中孵育两天，然后将它们转移到照明室中。从转化平板中选择单个菌落，并将它们划到TAP琼脂平板上。

要进行菌落PCR，首先将少量转化藻细胞加入10微升无菌水中。将溶液在 98 摄氏度下煮沸 15 分钟。类似地处理另一个PCR模板，以确认样品中农杆菌的缺失。

使用分子量标准在DNA琼脂糖凝胶上运行PCR样品，以验证所得片段的大小。转化的菌落能够在含有潮霉素和头孢噻肟的平板上生长。野生型菌落没有在盘子上生长。

获得了耐药性高达每升头孢噻肟70毫克的菌落。藻类样品中不存在pCAMBIA1302的菌落PCR扩增子。然而，在所有三种藻类样品中都检测到扩增子中的MGFP5G。

重复作为头孢噻肟传代培养物的藻类培养物显示毒力蛋白 E2 缺失，表明质粒缺失。观察到转化体和野生型菌株的藻类生长存在显著差异。尽管生长较低，但转化体在对细胞密度进行归一化时具有更高的荧光水平。