使用解离的内皮细胞、寄生虫和星形胶质细胞组装人多能干细胞衍生的血脑屏障或 iBBB,将三种类型的细胞组合在一个锥形管中,同时包括比计算的细胞数量多 10% 以考虑移液错误。将细胞混合物以 300 g 旋转三分钟。吸出上清液,使细胞沉淀中含有约50μL的培养基。
使用P200移液管,轻轻地将细胞沉淀重悬于残留培养基中,以产生单细胞浆液。将含有所得细胞浆液的试管放在冰上,并根据所需数量的 iBBB 向其添加足量的还原 GF 基底膜基质。均匀混合细胞,同时不引入任何气泡。
将 50 μL 所得细胞基质混合物移液到 48 孔或 96 孔玻璃底培养皿的孔中,并将其均匀分布在整个培养皿底部。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 至 40 分钟,以聚合基质,同时封装细胞。最后,向孔中加入 500 微升补充的星形胶质细胞培养基,并在培养物中维持 iBBB。
对于 96 孔板,向孔中加入 100 至 150 μL 培养基,直到它们充分显影用于下游测定,这通常需要两周时间。正确形成的iBBB在明场显微镜下显示为凝固的单个半透明圆盘。24小时后,鉴定出均匀分布的单细胞。
两周后,虽然难以定义,但可以看到更明显的结构。