Bu çalışma NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Girişimi, MJFF / ASAP Vakfı ve Amerika Beyin Hasarı Derneği tarafından desteklenmektedir. CG, NIH F31NS130909 tarafından desteklenmektedir. Şekil 1A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. iPSC'leri iBBB hücrelerine ayırma
NOT: Bu farklılaşma protokolleri daha önce Mesentier-Louro ve ark.34'te tanımlanmıştır.
<ol><li>Hücre kültürü plakalarının kaplanması<ol><li>Azaltılmış büyüme faktörü (GF) membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün. 500 μL bazal membran matrisini 49.5 mL DMEM ile seyreltin. Kaplama çözeltisinin erken polimerizasyonunu önlemek için bu çözeltiyi soğuk tutun.</li>
		<li>6 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın oyuğu başına 1-2 mL ekleyin. Kaplama solüsyonunu uygun ısıtılmış kültür ortamıyla değiştirmeden önce 37 °C'de en az 20 dakika bekletin.</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan iPSC'lerinin ETV2 ile indüklenebilir endotel hücrelerine farklılaşması Süre: 8 gün NOT: Bu protokol Blanchard ve ark.24 ve Qian ve ark.35'ten uyarlanmıştır. Verimi artırmak için Wang ve ark.36 tarafından tarif edildiği gibi, transkripsiyon faktörü ETV2'nin doksisiklin ile indüklenebilir ekspresyonunu kullanıyoruz. ETV2, PiggyBac plazmidi yoluyla tanıtıldı ve hücreler daha sonra transfekte edildi.<ol><li>Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar besleyici içermeyen pluripotent kök hücre ortamında indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri. NOT: İndüklenebilir iPSC'lerin PiggyBac plazmidi (yani puromisin) seçimi ile korunmasını öneririz</li>
		<li>Gün 0: Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri, 10 μM Y27632 ile desteklenmiş kök hücre ortamında azaltılmış GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine 20.800 hücre /cm2'de plakalayın.</li>
		<li>1. Gün: Ortamı DeSR1 [DMEM / F12 + glutamin takviyesi, 1x Minimum Esansiyel Orta Esansiyel Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA),% 1 penisilin-streptomisin (P / S)], 10 ng / mL BMP4, 6 μM CHIR99021 ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiştir.</li>
		<li>3. Gün: Ortamı 5 μg/mL doksisiklin ile takviye edilmiş DeSR2 [DMEM/F12 + glutamin takviyesi, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, %1/S] ile değiştirin.</li>
		<li>5. Gün: Ortamı 50 ng / mL VEGF-A, 2 μM forskolin ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR [İnsan Endotelyal Serumsuz Ortam, 1x MEM-NEAA, 1x B-27,% 1 P / S] ile değiştirin.</li>
		<li>7. Gün: Ortamı 50 ng / mL VEGF-A, 2 μM forskolin ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR ile değiştirin.</li>
		<li>8. Gün: ECs 1:3'ü bir proteaz-kollajenaz karışımı ile bölün ve 50 ng/mL VEGF-A ve 5 μg/mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara yeniden tohumlayın. NOT: Bu, tek tip vaskülatür oluşumu için EC'leri iBBB'lere kapsüllemek için en iyi zaman noktasıdır.</li>
		<li>10+ Gün: Hücreleri her 2-3 günde bir 50 ng/mL VEGF-A ve 5 μg/mL doksisiklin ile takviye edilmiş hECSR ile besleyin. Plakalar birleştiğinde hücreleri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile 1:3 oranında bölmeye devam edin. NOT: iPSC'den türetilen EC'ler, 8. günden itibaren herhangi bir noktada dondurulabilir. Hücreleri geçiş yapıyormuş gibi kaldırın. Peletleri EC dondurma ortamında [% 60 nakavt serum replasmanı (KSR),% 30 hECSR,% 10 DMSO, 50 ng / mL VEGF-A ve 10 μM Y27632] hücreleri 1: 3'e bölerek yeniden süspanse edin ve -80 ° C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.</li>
		<li>CD31 / PECAM1 veya VE-kaderine karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile beyin mikrovasküler endotel hücre farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan iPSC'lerinin perisitlere farklılaşması Süre: 6 gün NOT: Bu protokol Patsch ve ark.36'dan uyarlanmıştır.<ol><li>Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar kök hücre ortamında besleyicisiz koşullarda indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.</li>
		<li>Gün 0: Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 37.000-40.000 hücre/cm2'de (hücre hattına bağlı olarak) 10 μM Y27632 ile takviye edilmiş kök hücre ortamında indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine yerleştirin.</li>
		<li>1. Gün: Ortamı N2B27 [% 50 DMEM / F12 + glutamin takviyesi,% 50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, glutamin takviyesi, 1x N-2, 1x- B-27,% 1 P / S] ile değiştirin 25 ng / mL BMP4 ve 8 uM CHIR99021 ile desteklenmiştir.</li>
		<li>3-4. Günler: Ortamı 2 ng/mL Activin A ve 10 ng/mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27 ile değiştirin ve günlük olarak besleyin.</li>
		<li>5. Gün: PC'leri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile bölün ve 10 ng / mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27'de 35.000 hücre /cm2'de % 0.1 jelatin kaplı plakalara tohumlayın. NOT: Hücreleri yalnızca birleştikten sonra bölün. Bazı hatların bölünmeye hazır olması için birkaç gün daha gerekebilir; Hücreler birleşene kadar ortamı günlük olarak değiştirmeye devam edin.</li>
		<li>Her 2-3 günde bir medya değiştirerek 10 ng/mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27'deki PC'leri genişletin. Hücreler bir kez daha birleştikten ve ikinci bir geçişten geçtikten sonra PDGF-BB'yi ortamdan çıkarın. NOT: Perisitler, ikinci geçişten sonra iBBB'lerde kullanılmaya hazırdır. Genişletildikten sonra PC'ler dondurulabilir. Hücreleri geçiş yapacakmış gibi kaldırın, hücre peletini dondurma ortamında [%90 KSR ve %10 DMSO] yeniden süspanse edin ve -80 °C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. N2B27'de 35.000 hücre/cm2'de %0.1 jelatin kaplı plakalar üzerine çözdürün.</li>
		<li>PDGFRB ve NG2'ye karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile perisit farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan iPSC'lerinin nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) ve astrositlere farklılaşması Zamanlama: Toplam 45 gün (NPC'ler için 15 gün, astrositler için 30 gün) NOT: NPC farklılaşma protokolü Chambers ve ark.38'den uyarlanmıştır ve astrosit farklılaşması TCW ve ark.39'da açıklandığı gibidir.<ol><li>Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar kök hücre ortamında besleyicisiz koşullarda indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.</li>
		<li>Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 100.000 hücre/cm2'de 10 μM Y27632 ile takviye edilmiş kök hücre ortamında azaltılmış GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Kök hücre ortamını ertesi gün değiştirin. Hücreleri% >95 birleşme noktasına ulaşana kadar (hücre hattına bağlı olarak 3-4 gün) her gün beslemeye devam edin.</li>
		<li>NPC Gün 0: Ortamı N2B27 [%50 DMEM/F12 + glutamin takviyesi, %50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, glutamin takviyesi, 1x N-2, 1X-B-27, %1 P/S] ile 10 μM SB43152 ve 100 nM LDN193189 ile tamamlayın.</li>
		<li>NPC Günleri 1-9: Hücreleri günlük olarak 10 μM SB43152 ve 100 nM LDN193189 ile desteklenmiş N2B27 ile besleyin.</li>
		<li>NPC 10. Gün: NPC'leri proteaz-kollajenaz karışımı ile 1:3 oranında bölün ve 20 ng/mL FGF-bazik ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara tohumlayın.</li>
		<li>NPC Günleri 11 - 13: NPC'leri günlük olarak 20 ng/mL FGF-basic ile desteklenmiş N2B27 ile besleyin.</li>
		<li>NPC 14. Gün: NPC'leri proteaz-kollajenaz karışımıyla 1:3 oranında bölün ve 20 ng/mL FGF-bazik ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara yeniden tohumlayın.</li>
		<li>NPC Gün 15/Astrosit Gün 0: Bu, astrosit farklılaşmasının 0. günüdür. Hücreleri tam Astrosit ortamı () ile besleyin. NOT: NPC'ler, 20 ng/mL FGF-bazik ile desteklenmiş N2B27'de tutulabilir ve birleştiğinde geçilebilir. NPC'leri dondurmak için, hücre peletini dondurma ortamında [% 90 KSR ve% 10 DMSO] yeniden süspanse edin, hücreleri 1: 3'e bölün ve -80 ° C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. 20 ng/mL bFGF ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.</li>
		<li>Astrosit Günleri 1-30: Hücreleri her 2-3 günde bir ile besleyin. Hücreler %>90 birleştiğinde,'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde 15.000 hücre/cm2'de proteaz-kollajenaz karışımı ve plakası kullanılarak geçiş. NOT: Astrositler 30 gün içinde tamamen farklılaşmalıdır. Astrositler, -80 °C'de bir dondurma kabında dondurma ortamında [% 90 KSR ve% 10 DMSO] dondurulabilir. 'de 25.000-35.000 hücre/cm2'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.</li>
		<li>Nestin ve SOX2'ye karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile NPC farklılaşmasını doğrulayın. S100B ve CD44'e karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile astrosit farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>2. iBBB'nin montajı
<ol><li>Azaltılmış büyüme faktörü (GF) bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün. iBBB'ler %100 azaltılmış GF bazal membran matrisi içinde kapsüllendiğinden bu matrisi DMEM'de seyreltmeyin. Her iBBB, 50 μL matris gerektirir.</li>
	<li>Farklılaşmış EC'leri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının hECSR'ye (İnsan Endotelyal Serumsuz Ortam, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, %1 P/S) oranıyla konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini hECSR'de yeniden süspanse edin. NOT: 15 mL veya 50 mL'lik konik bir tüp kullanın, bu, ayrışmış hücrelerin ve ortamın hacmini barındıracak kadar büyüktür. Hücreler ayrıca birden fazla tüp arasında bölünebilir ve daha sonra yeniden süspansiyon üzerine yeniden birleştirilebilir.</li>
	<li>Farklılaşmış PC'leri proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının N2B27'ye 1: 3 oranında konik bir tüpe aktarın (% 50 DMEM / F12 + glutamin takviyesi,% 50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x glutamin takviyesi, 1x N-2, 1x B-27,% 1 penisilin-streptomisin [P / S]). Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini N2B27'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Farklılaşmış astrositleri proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, Astrosit Ortamını () tamamlamak için proteaz-kollajenaz karışımının 1:3 oranına sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak her hücre tipini sayın. Her bir hücre süspansiyonu tipini uygun ortamda 1 × 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.</li>
	<li>Her hücre tipi için hesaplanan hücre sayısını konik bir tüpte birleştirin: 50 μL iBBB, 2,5 × 105 EC, 5 × 104 PC ve 5 × 104 astrosit gerektirir. Pipetleme hatalarını hesaba katmak için hesaplanan hücre sayısından %10 daha fazlasını ekleyin. Hücre karışımını 300 × g'da 3 dakika döndürün. NOT: Giriş hücrelerinin kalite kontrolü için sabitlemek ve boyamak için her hücre tipinden kalan bazı hücrelerin 2D monokültürlerde kaplanması şiddetle tavsiye edilir. Her hücre tipini 35.000 hücre/cm2'de önceden hazırlanmış plakalar üzerine azaltılmış GF bazal membran matrisi ile kaplayın ve 3-4 gün sonra sabitleyin. Hücre tipi spesifik antikorlar için Tablo 1'e bakınız.</li>
	<li>Hücre peletinden ortamı aspire edin ve hücre peletinin üzerinde yaklaşık 50 μL süpernatan bırakın. Bir P200 kullanarak, tek hücreli bir bulamaç oluşturmak için hücre peletini artık ortamda nazikçe yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre bulamacını, iBBB başına 50 μL indirgenmiş GF bazal membran matrisinde istenen sayıda iBBB için 10 ng/mL VEGF-A ile desteklenmiş yeterince azaltılmış GF bazal membran matrisinde karıştırın ve hücreleri homojen bir şekilde karıştırmaya özen gösterin. NOT: Erken polimerizasyonu önlemek için hücreleri ve azaltılmış GF bazal membran matrisini bu aşamada buz üzerinde tutmak çok önemlidir.</li>
	<li>50 μL azaltılmış GF bazal membran matris karışımını 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabının kuyucuğuna pipetleyin. Hacmi tabağın dibine eşit olarak dağıtın (Şekil 1C).</li>
	<li>Azaltılmış GF bazal membran matrisinin polimerize olmasına izin vermek için iBBB'leri 37 °C'de 30-40 dakika inkübe edin ve matristeki hücreleri kapsülleyin.</li>
	<li>10 ng / mL VEGF-A, 5 μg / mL doksisiklin ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş 500 μL ekleyin.</li>
	<li>Ertesi gün ortamı 10 ng / mL VEGF-A ile desteklenmiş olarak değiştirin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirmeye devam edin. 2 hafta sonra VEGF-A takviyesini bırakın; iBBB'ler 2 hafta sonra aşağı akış tahlilleri için hazırdır.</li>
</ol>3. Aβ fibrilleri ile serebral amiloid anjiyopatinin (CAA) indüklenmesi
<ol><li>PBS'de 200 μM'de amiloid-β1-40 ve amiloid-β1-42 stok çözeltileri hazırlayın.</li>
	<li>2 haftalık iBBB'lerde iBBB ortamına Aβ'yi 20 nM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Hücreleri Aβ takviyeli ortamda 96 saat (4 gün) inkübe edin.</li>
	<li>96 saat sonra ortamı çıkarın ve sabitlemeye devam edin (bölüm 4).</li>
</ol>4. iBBB'nin sabitlenmesi ve boyanması
<ol><li>iBBB'yi sabitlemek için ortamı çıkarın, 1 mL PBS'de yıkayın ve gece boyunca 4 °C'de 500 μL %4 paraformaldehit içinde inkübe edin.</li>
	<li>% 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve 1 mL PBS'de 4 x (en az) 15 dakika durulayın.</li>
	<li>Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.3 PBST (% 0.3 Triton X-100 ile PBS) içinde hafifçe çalkalayarak geçirgenleştirin.</li>
	<li>Kültürleri bloke edici tamponda (% 0.3 PBST'de% 5 Normal Serum) oda sıcaklığında en az 1 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin. NOT: Kullanılan serum tipi, kullanılan ikincil antikorlar için konakçı türe bağlıdır. Örneğin, ikincil antikorlar için konakçı tür keçi ise, normal keçi serumu kullanın; Konakçı tür eşek ise, normal eşek serumu kullanın. Bu aynı zamanda gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak da yapılabilir.</li>
	<li>Birincil antikorları, bloke edici tamponda önerilen veya belirlenen konsantrasyona seyreltin.</li>
	<li>Bloke edici çözeltiyi birincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Eşit inkübasyon için iBBB'lerin antikor çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun; 100-150 μL, 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabında 50 μL'lik bir iBBB'yi kaplamak için yeterlidir. Hafifçe çalkalayarak gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikoru çıkarın. İBBB'leri %0,3 PBS'de 3 x 10-20 dakika yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikoru, bloke edici tamponda önerilen veya belirlenen konsantrasyona seyreltin. Ek olarak, önerilen veya belirlenen konsantrasyonda ikincil antikor çözeltisine Hoechst gibi bir nükleer leke ekleyin.</li>
	<li>Son PBS yıkamasını ikincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Eşit inkübasyon için iBBB'lerin antikor çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun; 100-150 μL, 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabında 50 μL'lik bir iBBB'yi kaplamak için yeterlidir. Hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. NOT: Bu, gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak da yapılabilir.</li>
	<li>PBS'de yıkama başına en az 1 saat boyunca iBBB'leri 4-5x yıkayın. Numuneler görüntülenene kadar PBS veya solma önleyici montaj ortamında 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntülemek için, iBBB'leri cam tabanlı plakalarda veya tabaklarda tutun. iBBB'leri yerinde tutmak için camın üzerine bir cam lamel yerleştirin (Şekil 1D).</li>
</ol>

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

BBB disfonksiyonu bir komorbiditedir ve potansiyel olarak çok sayıda nörolojik hastalıkta bir neden veya şiddetlendirici faktördür 7,40,41. Bununla birlikte, nörovasküler hastalığı olan insanlarda BBB'nin işlev bozukluğu ve parçalanmasının altında yatan moleküler ve hücre biyolojisini incelemek neredeyse imkansızdır. Bu protokolde sunulan indüklenebilir-BBB (iBBB), vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç a...

Kan-beyin bariyeri (BBB), uygun nöronal fonksiyon için ideal bir ortam sağlamak için merkezi sinir sistemini (CNS) çevreden ayıran önemli bir mikrovasküler ağdır. Metabolik homeostazı 1,2,3,4 koruyarak, atıkları temizleyerek 4,5,6 ve beyni patojenlerden ve toksinlerdenkoruyarak 7,8 maddelerin CNS'ye akışını ve akışını düzenlemede kritik bir role sahiptir.
BBB'nin birincil hücre tipi endotel hücresidir (EC). Mezoderm soyundan türetilen endotel hücreleri, vaskülatür 1,9'un duvarlarını oluşturur. Mikrovasküler EC'ler, membranlarının 10,11,12,13,14 geçirgenliğini büyük ölçüde azaltmak için birbirleriyle sıkı bağlantılar oluştururken, besinlerin CNS'ye girip çıkmasını kolaylaştırmak için taşıyıcıları eksprese eder 1,4,12,14. Mikrovasküler EC'ler, mikrovasküler fonksiyonu ve homeostazı düzenleyen perisitler (PC'ler)-duvar hücreleri ile çevrilidir ve BBB'nin moleküllere ve bağışıklık hücrelerine geçirgenliğini düzenlemek için kritik öneme sahiptir 15,16,17. Majör bir glial hücre tipi olan astrosit, BBB'yi oluşturan son hücre tipidir. Astrosit uç ayakları EC-PC vasküler tüplerinin etrafını sararken, hücre gövdeleri beyin parankimine uzanarak nöronlar ve damar sistemi1 arasında bir bağlantı oluşturur. Farklı çözünen ve substrat taşıyıcıları, BBB fonksiyonu18,19,20,21'de kritik bir role sahip olan astrosit uç ayaklarında (örneğin, aquaporin 4 [AQP-4]) lokalizedir.
BBB, uygun beyin sağlığı fonksiyonunun sürdürülmesinde kritik öneme sahiptir ve Alzheimer hastalığı (AD)22,23,24,25, multipl skleroz 7,26,27,28, epilepsi 29,30 ve inme31,32 dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıkta BBB'nin işlev bozukluğu bildirilmiştir . Serebrovasküler anormalliklerin nörodejenerasyonda merkezi bir rol oynadığı ve iskemik ve hemorajik olaylara duyarlılığın artmasına katkıda bulunduğu giderek daha fazla kabul edilmektedir. Örneğin, AD hastalarının %90'ından fazlasında serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatür boyunca amiloid β (Aβ) birikimi ile karakterize bir durumdur. CAA, BBB geçirgenliğini arttırır ve BBB fonksiyonunu azaltır, CNS'yi iskemi, hemorajik olaylar ve hızlandırılmış bilişsel gerilemeye karşı savunmasız bırakır33.
Yakın zamanda, bir 3D matriste kapsüllenmiş EC'leri, PC'leri ve astrositleri içeren, hasta kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen insan BBB'sinin in vitro bir modelini geliştirdik (Şekil 1A). iBBB, vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç ayaklarının vaskülatür24 ile lokalizasyonu dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili etkileşimleri özetler. APOE4'ün aracılık ettiği CAA duyarlılığını modellemek için iBBB'yi uyguladık (Şekil 1B). Bu, APOE4'ün CAA'yı teşvik ettiği nedensel hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamamızı ve CAA patolojisini azaltan ve APOE4 farelerinde in vivo öğrenme ve hafızayı geliştiren terapötik stratejiler geliştirmek için bu içgörülerden yararlanmamızı sağladı24. Burada, BBB'yi insan iPSC'lerinden yeniden yapılandırmak ve CAA'yı in vitro modellemek için ayrıntılı bir protokol ve video eğitimi sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6e10 amyloid-&#946; antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SIG-39320</td>
			<td>Used at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>20-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amyloid-beta 40 fibril</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-24235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amyloid-beta 42 fibril</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquaporin-4 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-53234</td>
			<td>Used at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte basal media and supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-05ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cyamn Chemical</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G slide mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100502-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom 48-well Culture Dishes</td>
			<td>Mattek Corporation</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial Serum-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td>Use serum to match secondary antibody host</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF385</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF806</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>&#160;Catalog #168805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100B antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2532-100uL</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB43152</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>22870</td>
			<td>Used at 25uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-cadherin (CD144) antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF938</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA3-39100-A488</td>
			<td>Dilution = 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstruction of the blood-brain barrier in vitro to model and therapeutically target neurological disease

Kan-beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sisteminin (CNS) önemli bir fizyolojik bileşenidir, besinleri korur, atıkları temizler ve beyni patojenlerden korur. BBB'nin doğal bariyer özellikleri, nörolojik hastalıkları tedavi etmek için CNS'ye terapötik ilaç verilmesi için bir zorluk teşkil etmektedir. Bozulmuş BBB fonksiyonu nörolojik hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatürde amiloidin birikmesi ve riskli bir BBB'ye yol açması, Alzheimer hastalığının (AD) çoğu vakasında bir komorbiditedir ve BBB disfonksiyonunun veya bozulmasının nörodejenerasyonda rol oynayabileceğini düşündürür. İnsan BBB dokusuna sınırlı erişim nedeniyle, uygun BBB fonksiyonuna ve BBB dejenerasyonuna katkıda bulunan mekanizmalar bilinmemektedir. Bu sınırlamaları ele almak için, endotel hücrelerini, perisitleri ve astrositleri bir 3D matriste birleştirerek insan pluripotent kök hücre türevi bir BBB (iBBB) geliştirdik. iBBB, BBB'de bulunan anatomiyi ve hücresel etkileşimleri özetlemek için kendi kendine toplanır. iBBB'lerin amiloid ile tohumlanması, CAA'nın önemli yönlerini yakalar. Ek olarak, iBBB, genetik ve yaşam tarzının hastalık riskini nasıl etkilediğini araştırmak için serebrovasküler hastalık ve nörodejenerasyonda rol oynayan genetik ve çevresel faktörleri modüle etmek için esnek bir platform sunar. Son olarak, iBBB, CNS'ye terapötik iletimi optimize etmek için ilaç taraması ve tıbbi kimya çalışmaları için kullanılabilir. Bu protokolde, insan pluripotent kök hücrelerinden kaynaklanan üç tip hücrenin (endotel hücreleri, perisitler ve astrositler) farklılaşmasını, farklılaşmış hücrelerin iBBB'ye nasıl birleştirileceğini ve ekzojen amiloid kullanılarak CAA'nın in vitro olarak nasıl modelleneceğini açıklıyoruz. Bu model, hem biyolojik sadakate hem de deneysel esnekliğe sahip bir sistemle canlı insan beyin dokusunu incelemenin zorluğunun üstesinden gelir ve insan BBB'sinin ve nörodejenerasyondaki rolünün sorgulanmasını sağlar.

The blood-brain barrier (BBB) is a key microvascular network separating the central nervous system (CNS) from the periphery to maintain an ideal environment for proper neuronal function. It has a critical role in regulating the influx and efflux of substances into the CNS by maintaining metabolic homeostasis1,2,3,4, clearing waste4,5,6, and protecting the brain from pathogens and toxins7,8.
The primary cell type of the BBB is the endothelial cell (EC). Endothelial cells, derived from the mesoderm lineage, form the walls of the vasculature1,9. Microvascular ECs form tight junctions with each other to greatly decrease the permeability of their membrane10,11,12,13,14 while expressing transporters to facilitate the movement of nutrients into and out of the CNS1,4,12,14. Microvascular ECs are encircled by pericytes (PCs)-mural cells that regulate microvascular function and homeostasis and are critical for regulating the permeability of the BBB to molecules and immune cells15,16,17. The astrocyte, a major glial cell type, is the final cell type comprising the BBB. Astrocyte end-feet wrap around the EC-PC vascular tubes while the cell bodies extend into the brain parenchyma, forming a connection between neurons and vasculature1. Distinct solute and substrate transporters are localized on astrocyte&#160;end-feet (e.g., aquaporin 4 [AQP-4]) that have a critical role in BBB function18,19,20,21.
The BBB is critical in maintaining proper brain health function, and dysfunction of the BBB has been reported in many neurological diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD)22,23,24,25, multiple sclerosis7,26,27,28, epilepsy29,30, and stroke31,32. It is increasingly recognized that cerebrovascular abnormalities play a central role in neurodegeneration, contributing to increased susceptibility to ischemic and hemorrhagic events. For example, more than 90% of AD patients have cerebral amyloid angiopathy (CAA), a condition characterized by the deposition of amyloid &#946; (A&#946;) along the cerebral vasculature. CAA increases BBB permeability and decreases BBB function, leaving the CNS vulnerable to ischemia, hemorrhagic events, and accelerated cognitive decline33.
We recently developed an in vitro model of the human BBB, derived from&#160;patient-induced pluripotent stem cells, which incorporates ECs, PCs, and astrocytes encapsulated in a 3D matrix (Figure 1A). The iBBB recapitulates physiologically relevant interactions, including vascular tube formation and localization of astrocyte end-feet with vasculature24. We applied the iBBB to model the susceptibility of CAA mediated by APOE4 (Figure 1B). This enabled us to identify the causal cellular and molecular mechanisms by which APOE4 promotes CAA, and leverage these insights to develop therapeutic strategies that reduce CAA pathology and improve learning and memory in vivo in APOE4 mice24. Here, we provide a detailed protocol and video tutorial for reconstructing the BBB from human iPSCs and modeling CAA in vitro.

Author Spotlight: A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer&#039;s Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model 

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Düzgün şekillendirilmiş bir iBBB, tek bir yarı saydam diskte katılaşır (Şekil 3A). iBBB'nin birkaç gün sonra ilk pipetlendiği yüzeyden ayrılması normaldir. Bu önlenemez, ancak medyayı değiştirirken yanlışlıkla iBBB'yi aspire etmemek için dikkatli olunursa, iBBB'nin düzgün oluşumu için büyük bir endişe kaynağı değildir. 24 saat sonra, eşit olarak dağılmış, tek hücreler parlak alan mikroskobu altında tanımlanabilir (Şekil 3B</stron...

Watch this Scientific Journal Video about A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model at JoVE.com

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

Amacımız, Alzheimer hastalığının patogenezine aracılık eden moleküler ve hücresel mekanizmaları belirleyerek terapötik ve tanısal fırsatları ortaya çıkarmaktır. Şu anda, Alzheimer hastalığının başlangıcında ve gelişiminde rol oynayan moleküler yollar ve mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bunun nedeni, fare modellerinin ve diğer in vitro Alzheimer hastalığı modellerinin, hastalığın gelişimi için çok önemli olan benzersiz insan biyolojisini özetleyememesidir.Alzheimer hastalığı, demans ve diğer nörodejenerasyon biçimleriyle ilişkili serebrovasküler patolojileri incelemek için uygulanabilecek kan-beyin bariyerinin in vitro bir modelini geliştirdik. Bu model, Alzheimer hastalığı için en güçlü risk faktörü olan APOE4'ün, patojenik amiloid yükünü artırmak için kısmen parazite özgü bir yol yoluyla hareket ettiğini göstermek için kullanılmıştır. Böyle bir in vitro kan-beyin bariyeri modeli, kişiselleştirilmiş terapötik ve tanısal yaklaşımlara olanak tanır.3D in vitro kan-beyin bariyeri modelimiz, vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç ayaklarının vaskülatür ile lokalizasyonu dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili etkileşimleri göstermektedir. Ayrıca amiloid patolojisi de dahil olmak üzere hastalıkla ilgili fenotipleri modelleme yeteneğine sahiptir. Son olarak, hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kullanımı, istenen herhangi bir genetik arka planın incelenmesine izin verir.İn vitro kan-beyin bariyeri modelini kullanarak, patolojik serebrovasküler amiloid birikimine aracılık eden yolları keşfettik. Bu, şu anda takip ettiğimiz yaşlı APOE4 farelerinde bu patolojiyi tersine çevirebilecek terapötik stratejileri keşfetmemize neden oldu.

reconstruction-blood-brain-barrier-vitro-to-model-therapeutically

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Neuroscience

Unit 1

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

Pharmacokinetics: Drug Distribution and Protein Binding

SCIENTISTS IN ACTION

1.4K Görüntüleme.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. Amacımız, Alzheimer hastalığının patogenezine aracılık eden moleküler ve hücresel mekanizmaları belirleyerek terapötik ve tanısal fırsatları ortaya çıkarmaktır. Şu anda, Alzheimer hastalığının başlangıcında ve gelişiminde rol oynayan moleküler yollar ve mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bunun nedeni, fare modellerinin ve diğer in vitro Alzheimer hastalığı modellerinin, hastalığın gelişimi için çok önemli olan benzersiz insan biyolojisini öz...