首先,用含氧生理盐水灌注外部溶液五分钟。用移液管将10微升解剖溶液转移到培养皿中。现在,使用注射器针头和显微镜仔细解剖麻醉的已建立野生型和敲除型苍蝇的大脑。
用移液管将准备好的大脑转移到装有五毫升外部溶液的记录培养皿中。用 C 锋利的支架固定大脑。接下来,以 20 倍的速度捕获每个大脑的共聚焦图像。
使用 XYT 扫描模式,以额外的 4.5 倍数字扩增识别蘑菇体神经元。将激光激发设置为 488 纳米,激光功率为 16 微瓦,以获得全脑 GCaMP6m 发射。然后将扫描参数设置为 1400 速度,像素大小为 256 x 256 像素。
将采集速率设置为 5.3 赫兹并记录 3 分钟。分析五到八个感兴趣区域的荧光。手动确定蘑菇体神经元的细胞体作为感兴趣区域。
使用图像 J 标记已识别的神经元并测量其荧光强度。分析GCaMP6m的荧光数据,如图所示。将增加 2 到 2.5 个标准差的细胞内荧光定义为小尖峰,将增加超过 2.5 个标准差的荧光定义为大尖峰。
在苍蝇的蘑菇体中观察到钙信号。cac 击倒苍蝇显示出比小尖刺更多的大尖峰。