首先，使用 EV 陷阱方法从人尿中获得的干燥细胞外囊泡样本。用所示组分制备新鲜的裂解缓冲液。然后加入 100 微升裂解缓冲液以溶解干燥的 EV 样品。
在 95 摄氏度下加热样品 10 分钟，同时以 1， 100 RPM 振荡。将样品冷却至室温后，加入400微升50毫摩尔TEAB，将其稀释五倍。根据制造商的说明，使用BCA检测试剂盒测量蛋白质浓度。
将胰蛋白酶和赖氨酸 C 混合物加入样品中，在 37 摄氏度下孵育过夜，以 1， 100 RPM 振荡。然后加入 50 微升 10% 三氟乙酸或 TFA 对样品进行酸化。此外，向样品中加入600微升乙酸乙酯，并将混合物涡旋两分钟。
将样品以 20， 000 G 离心三分钟，并在不干扰界面的情况下小心地去除上层。使用真空离心浓缩器干燥水相。现在将干燥的样品重悬于200微升0.1%TFA中以酸化肽。
要对样品进行脱盐，请使用 CA18 脱盐尖端并用 200 微升 0.1% TFA 和 80% 乙腈进行调节，然后用 200 微升 0.1% TFA 进行两次洗涤。将酸化的肽样品装入尖端，并用 200 微升 0.1% TFA 洗涤 3 次。用 200 微升 0.1% TFA 和 80% 乙腈洗脱肽。
如图所示抽取洗脱液后，将干燥至磷酸化蛋白质组学样品重悬于200μL上样缓冲液中，用于磷酸肽富集。向样品中加入 50 微升珠子，并在室温下剧烈摇动 20 分钟。将带有珠子的样品加载到烧结的尖端中，并以 100 G 离心一分钟，用 200 微升上样缓冲液连续洗涤尖端，洗涤缓冲液 1 和 2。
将带有珠子的尖端放入新管中以收集逃逸的磷酸肽。向吸头中加入 50 微升洗脱缓冲液，以 20 G 离心两分钟，然后使用真空离心浓缩器干燥逃逸的磷酸肽。
