SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

首先，在六孔板中，接种一毫升人胚胎肾293T细胞。加入两毫升完整的DMEM。第二天，用新鲜的无抗生素培养基替换培养基，以制备用于转染的细胞。

为了转染贴壁细胞，首先，通过将质粒 DNA 添加到 100 μL Opti-MEM 中来制备混合物 A。接下来，将 17.5 微升聚乙烯亚胺加入 100 微升 Opti-MEM 中。混合混合物 A 和 B 的内容物，然后孵育。

在孵育过程中，每三到四分钟轻弹动试管以增强混合效果。将整个体积的混合物加入装有HEK 293T细胞的平板中。转染 16 至 20 小时后，用新鲜的完全 DMEM 替换培养基。

将平板在37摄氏度的5%二氧化碳下孵育以产生假型病毒。转染 72 小时后，将上清液收获到收集管中。在室温下以1,600G离心上清液7分钟。

然后通过0.45微米醋酸纤维素过滤器过滤上清液。在 96 孔板的孔中分配 50 μL 完全 DMEM。将 A 行留空。

将100微升假病毒原液加入A行的孔中，接下来，将50微升溶液从A行移液到B行，重复此过程至G行以获得连续稀释液。从含有培养的易感HEK 293T ACE2细胞的平板中取出用尽的培养基，并用4毫升DPBS洗涤细胞。然后用一毫升胰蛋白酶EDTA在DPBS盐水中分离细胞。

现在将 50 微升易感细胞悬液加入每个含有假型病毒的孔中。将板在 37% 二氧化碳下在 5% 二氧化碳下孵育 48 小时。向每个孔中加入 100 μL 荧光素酶试剂。

孵育后，将每个孔的内容物转移到黑色 96 孔板中。然后在读板器中读取印版。在 96 孔板中，将 50 μL 新鲜完全 DMEM 加入到 B 行至 H 的 1 至 10 列中。将 95 μL 新鲜完全 DMEM 加入到 A 行的相应孔中。现在将 50 μL 完全 DMEM 添加到第 11 列的孔中，将 100 μL 的 DMEM 添加到第 12 列中。

将 5 μL 热灭活血清样品移液至行 A.用多通道移液管混合第一行样品，并将 50 μL 含培养基的血清从 A 行转移到 B 行，直至行 H.将 50 μL 含有稀释的假病毒培养基从 1 列分发到 1 至 11 列的每个孔中。将板在 37% 二氧化碳下 5 摄氏度孵育一小时。在五毫升中制备敏感HEK293T ACE2细胞的悬浮液。

向每个孔中加入 50 μL 细胞悬液，然后在进行荧光素酶测定之前孵育。较低的血清稀释度导致病毒进入细胞减少。中和百分比的增加证实了这一点。