CENP-E 敲除 HeLa 细胞的转染、分离和筛选

首先，向HeLa细胞中加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37摄氏度下孵育两到三分钟。通过移液轻轻解离细胞，并以 1 比 4 的比例将它们接种到新平板中以进行细胞传代。为了将质粒转染到 HeLa 细胞中，将 1 μg 经验证的 PX458 sgRNA 质粒与 50 μL 还原血清培养基混合在试管 A.In 管 B 中，轻轻混合 2 μL 转染试剂和 50 μL 还原血清培养基，并在室温下孵育 5 分钟。

然后，将试管 A 和 B 中的内容物混合，并在室温下再孵育五分钟。将混合物加入 12 孔板中，并将细胞在 37 摄氏度下孵育 6 小时。在孵育结束时，用新鲜的DMEM培养基替换培养基。

24 或 48 小时后，通过在荧光显微镜下检查 HeLa 细胞来评估转染效率。使用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 完全解离转染的 HeLa 细胞，并在 37 摄氏度下孵育 3 至 5 分钟。接下来，使用 Neubauer 腔室或自动细胞计数器对细胞进行计数。

按照连续稀释方法，将细胞铺板到三个独立的 96 孔板中，用于每个转染群体。将细胞放回加湿培养箱中一到两周。对于基于表型的 CENP-E 敲除筛选和验证，在 24 孔或 12 孔板中解离并扩增细胞 5 至 7 天。

使用具有10倍和20倍放大倍率物镜的倒置显微镜筛选具有较小菌落直径的突变细胞。接下来，按照制造商的说明使用柱式动物基因组 DNA 提取试剂盒收获用于 DNA 提取的细胞，并设置聚合酶链反应。按照制造商的实验方案将靶DNA连接到pMD18-T载体中。

将连接的质粒转染到感受态DH5-α细胞中，并进行培养以进行克隆选择。为了鉴定 CENP-E 敲除的类型，请按照制造商的指南在质粒提取试剂盒的帮助下分离质粒 DNA。接下来，使用M13正向和反向引物对每个菌落的质粒DNA进行Sanger测序。

将野生型和 CENP-E 突变型 HeLa 细胞接种在 24 孔板中的 12 毫米玻璃盖玻片上。除去完整的DMEM培养基，并在室温下使用4%多聚甲醛和PBS溶液固定细胞10分钟。接下来，在室温下用DAPI染色细胞核五分钟。

使用荧光显微镜观察和验证基于染色体比对表型的CENP-E突变细胞。菌落的表型筛选显示，与对照组相比，CENP-E敲除细胞的染色体错位增加。