Preparation of Human Intestinal Organoid Monolayers for Live Fluorescence Imaging

首先，在水中制备每毫升 1 毫克胶原蛋白 IV 溶液，并将 95 微升该溶液加入 10 孔成像底室载玻片的每个孔中。将载玻片在 37 摄氏度下孵育 30 分钟至两个小时以覆盖孔。从培养的 3D 人肠道类器官中，在最后一次传代后 5 至 7 天从孔中除去 WRNE 维持培养基。

然后加入 500 微升 1xPBS，每孔含有 0.5 毫摩尔 EDTA。使用预先编码的 1 毫升吸头，轻轻移液以将 BMM 从板上分离。将悬浮液转移到预先编码的 15 毫升锥形管中。

用额外的 500 微升 PBS EDTA 溶液冲洗每个孔。离心悬浮液并除去上清液和残留的BMM。然后，使用预先编码的尖端将沉淀重悬于含有五毫摩尔EDTA的三毫升PBS中。

再次离心并重悬于两毫升酶解离缓冲液中。将试管在 37 摄氏度下孵育五分钟。然后，加入三毫升CMGF-与10%FBS，并轻轻混合。

离心并向沉淀中加入一毫升CMGF。用力移液混合物 80 至 100 次，将类器官分解成单个细胞。离心并将沉淀重悬于一毫升WRNE培养基中。

获得细胞计数并稀释细胞悬液，以达到 100 μL 中 1.25 乘以 10 对 5 个细胞。接下来，从先前准备好的板中取出胶原蛋白溶液，避免接触孔底。然后每孔加入 100 微升制备的细胞溶液。

在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育 24 小时。每 24 小时后用每孔 100 毫升分化培养基替换培养基，直至汇合。在此之后，单层产品就可以用于下游应用了。