首先，设置落射荧光显微镜。成像前，将 Stage Top 培养箱预热至 37 摄氏度，并以每分钟 0.02 升的速度在腔室中运行加湿的二氧化碳。然后将含有受感染单层的载玻片放入培养箱室并密封盖子。
在明场照明下使用 20X 物镜，选择单层内视场的 X 和 Y 坐标。优化成像参数并使用 488 纳米的激发波长获取图像。为最大限度地减少光毒性，请将光源设置为 50% 功率，曝光时间为 50 毫秒。
确保没有像素饱和，并进行调整以检测荧光钙传感器的整个动态范围。设置成像环路，并在一分钟环路中在每个选定的 X 和 Y 坐标处采集图像，并连续获取该环路中的图像。对于荧光标记的病毒，每 10 个循环在适当的通道上采集图像。
如果使用非荧光病毒，请在成像后进行氨基荧光染色。首先，用 100 微升甲醛固定单层。孵育后，取出固定剂并用100微升50毫摩尔氯化铵淬火10分钟。
除去氯化铵后，在室温下用100微升0.1%Triton X-100透化单层1小时。然后取出溶液，加入100微升封闭溶液，孵育一小时。然后除去封闭溶液，加入100微升一抗，在1X PBS中欺骗。
在 4 摄氏度下孵育过夜，轻轻摇晃。孵育后，除去一抗并用 1X PBS 洗涤 3 次。最后，加入 100 微升在 1X PBS 中欺骗的荧光偶联二抗。
为防止光漂白，请保护板避光并在室温下孵育两个小时。孵育后除去二抗，并用DAPI溶液对样品进行染色。然后将固定的单层放入 100 微升 1X PBS 中进行成像。
将载玻片放回显微镜载物台上。从实时成像运行中重新加载 X 和 Y 坐标，并在与用于染色的二抗相对应的通道上对每个多点进行成像。参考实时成像运行中的图像，以确保捕获相同的点。
使用这种技术，在对 hIO 单层进行评分后，在该单层中对轮状病毒感染进行成像。对于表达荧光蛋白的轮状病毒重组株，如mRuby，在活体成像过程中验证了感染。而当使用不表达标记物的菌株时，成像后通过免疫荧光检测感染。
