首先，标记三组无菌 1.7 毫升试管和一组无菌 15 毫升锥形底管。准备带有 15 毫升试管插件的旋转桶离心机，并预冷至 4 摄氏度。取含有转染 293FT 细胞的 6 孔细胞培养板。
从孔中吸出培养基。加入 250 微升胰蛋白酶-EDTA，并在 37 度下孵育，直到细胞开始分离。然后向每个孔中加入 1 毫升补充了 10% FBS 的测定培养基，并用力移液以制备单细胞悬液。
将 1 mL 细胞悬液转移到预先标记的 15 mL 试管中。向每个试管中加入 1 毫升补充 10% FBS 的检测培养基，并倒置 5 次以混合。然后立即将 20 μL 细胞悬液转移到 1 组试管中。
现在，将 15 mL 试管在预冷的离心机中以 250 g 离心 5 分钟。将 20 μL 台盼蓝细胞染色剂与组 1 中的细胞混合，并使用细胞计数仪或血细胞计数器计数。从离心机中取出 15 mL 试管后，从细胞沉淀中吸出培养基，并将沉淀重悬于无血清检测培养基中，以制备单细胞悬液。
要在 384 孔板和 6 孔板中充胀细胞，请将 15 毫升试管倒置数次以获得均匀的细胞悬液，并将 500 微升转移到 1.7 毫升试管中，分为第二组和第三组。将 0.5 μL DMSO 加入到第 2 组，加入 0.5 μL Halo 618 配体到第 3 组试管中并充分混合。将 DMSO 和配体阳性细胞悬液转移到试剂储液槽的单独孔中。
使用多通道移液器将 40 μL 每种悬浮液转移到 384 孔培养板中。将剩余细胞转移到新鲜的 6 孔培养板中，进行后续的蛋白质印迹分析，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 384 孔板和 6 孔板过夜。取在 37 摄氏度预热的无血清检测培养基。
在无血清测定培养基中以 1：100 稀释解冻的纳米荧光素酶底物，并将其转移到试剂储液槽中。使用多通道移液器，将 10 微升底物混合物转移到 384 孔培养板的每个孔中。轻轻旋转板 1 分钟。
将 384 孔板插入多功能读板器中，并记录所有带有细胞的孔的 460 和 618 纳米发射。使用给定的方程式计算载体阳性和配体阳性的原始BRET比率（以milliBRET单位为单位）。通过从配体阳性的 BRET 比率中减去载体阳性的 BRET 比率来计算校正的 BRET 比率。
纳米CRAFS259A突变体使 BRET 信号降低约 45%，纳米CRAFS621A突变体降低约 25%双突变体几乎消除了 BRET 信号。
