首先,准备夹具支架和金属夹具。将匹配的夹具支架与每个金属夹具一起放入安装站。将湿的高压灭菌纸片放在金属夹的顶部。
用手术刀沿着夹子的内边缘剪纸。再剪两张小纸片并保持湿润。使用尖头镊子,将八个核心外植体放在金属夹子之间的纸上,它们的端点在夹子上。
用较小的纸片覆盖核心外植体的端点,并在上面放上金属夹。使用螺丝刀和小螺钉将芯外植体固定在金属夹和夹具支架之间。小心地将夹紧的核心外植体转移到硅胶培养室中,并用两毫升标准细胞培养基填充这些室。
然后用额外的螺钉固定组件。为了制备胶原水凝胶,首先使用细胞分离溶液从组织培养皿中去除靶细胞。然后在室温下以 400G 离心 5 分钟,然后重悬于 1 毫升标准培养基中。
接下来,通过将 10 微升 PBS、1.28 微升一摩尔 NaOH 和 8.72 微升双蒸水混合来制备交联溶液。加入多达 12 个组装体的细胞悬液,并将试管放在冰上。调整细胞悬液,以达到以下最终浓度。
通过添加 80 微升胶原蛋白,每个组合体一个,单独制备胶原蛋白溶液,然后将试管放在冰上。一旦溶液在冰上准备好,从含有夹紧的核心外植体的腔室中吸出细胞培养基。将胶原蛋白溶液加入交联溶液中,并通过快速移液混合而不会产生气泡。
将 200 微升混合溶液加入硅胶室的凹槽中,以覆盖单个肌腱核心外植体。让水凝胶在 37 摄氏度下聚合 50 分钟。然后小心地用 1.5 毫升相应的共培养基填充硅胶培养箱,将其移液到腔室的角落。
将腔室放入大型培养皿或无菌盒中,然后再放入培养箱中。在适当的条件下培养组装物,每周更换两次培养基。用剪刀从夹子上取下组件夹子。
如果需要,使用镊子将核心外植体与外部水凝胶隔室分开。在病变样培养条件下培养组合体超过 21 天后,观察到核心外植体保持机械可拉伸、外观不变、视觉上可区分且物理上可与周围的水凝胶分离。此外,周围的水凝胶随着时间的推移而压实,这取决于跟腱衍生的成纤维细胞群以最快的速度收缩其周围的水凝胶。
对 3D 胶原水凝胶中活力、形态和细胞扩散的共聚焦显微镜评估显示,在组装体培养期间,活力至少保留到第 7 天。此外,通过转录组学分析,Vegfa 和 Mmps 的基因表达在核心外植体中显著增加。同样,分泌组分析检测到核心外植体中存在细胞因子,例如血管内皮生长因子。