在将灭菌管连接到生物芯片之前，先用 200 微升 PBS 冲洗管，然后用 200 微升 EC 培养基冲洗管。用新鲜制备的细胞培养基冲洗上下腔室后，将储液槽插入生物芯片的出口侧，并将储液槽与管道连接到生物芯片的入口。对于循环培养基融合，将管道连接到储液槽和生物芯片。
现在用 500 μL 的 EC 培养基填充储液槽。将生物芯片与管道连接，以每分钟 21 微升的流速开始富注。第二天，停止大量并清空储液罐。
在无菌安全柜下，将 500 微升 EC 培养基移液到储液槽中，然后用 200 微升 RPMI plus 培养基轻轻冲洗下腔室。然后以每分钟 21 微升的流速重新开始灌注。要在第 12 天到第 14 天建立气液界面，请打开下腔室的塞子并小心吸收介质，直到看到气泡。
确保去除通道和腔室中的所有液体后，小心关闭端口，用新鲜制备的血管 EC 培养基填充储液槽，并仅在上腔室继续大量培养，直到第 14 天。断开生物芯片与流路系统的连接。取下管子后，在显微镜下检查生物芯片中的细胞层是否细胞汇合。
用 PBS 洗涤生物芯片腔以去除细胞培养基。将 300 微升 4% 多聚甲醛溶液的 PBS 溶液添加到上腔室中，将 200 微升添加到下腔室中。孵育 10 分钟后，用 PBS 洗涤腔室 3 次。
对于透化，加入 300 微升 0.25%Triton X 100 的 PBS 溶液并孵育 30 分钟，用 PBS 洗涤后，在两个腔室中吸取 300 微升 3% 牛血清白蛋白的 PBS 溶液并孵育 1 小时。对于免疫荧光染色，使用适当的稀释比例为每个膜使用 3% BSA 制备 50 μL 抗体溶液。要接触生物芯片内的细胞，请在腔外进行精确切割并去除粘合箔。
使用手术刀，通过去除密封在生物芯片上的边缘来切出膜。将膜分成两部分后，用镊子收集膜片并放在显微镜载玻片上染色，向每个膜片中加入 50 微升抗体溶液，并在 4 摄氏度下避光孵育过夜。用 PBS 洗涤膜 3 次后，在标记的载玻片上加入一滴封固剂，并放置相应的膜。
在膜顶部添加一滴封固剂，并放置盖玻片。人脐静脉内皮细胞免疫荧光染色显示共培养 14 天后形态学改变和马可蛋白表达。在血管侧，内皮细胞边界的 V 相干表达表明汇合和内皮屏障形成。
评估上皮侧的 ecaherrin 和表面活性剂蛋白 A 表达，指示肺泡上皮完整性和功能。
