对 FFPE 组织进行免疫组织化学后，使用数字病理成像仪对切片进行成像。启动软件以执行注释图像的光谱解混。选择 文件，然后单击 打开图片，然后选择 QPTIFF 文件以将图像上传到软件中。
允许标记为 Informed Projects 的图章上传到项目中。加载为自发荧光补偿准备的 QPTIFF 文件。在图像工具上选择自发荧光，从未染色的玻片上通过自发荧光结构（如红细胞和胶原蛋白）在图像上画一条线，以补偿自发荧光。
然后导航到 编辑标记和颜色 部分。分配与 Opal 荧光基团匹配的标记名称，并将颜色设置调整为您喜欢的选项。选择位于界面左下角的 Prepare All 以启动荧光基团的解混。
检查所有图像以检查所有信号的可见性以及 unmixing 过程是否成功完成。选择眼球图标以关闭和逐个打开所有标记以检查质量。现在导航到 导出 选项卡并通过单击位于导出目录下的 浏览 按钮创建一个新的空导出目录。
在 images to export 选项卡下选择 composite image 和 component images multi-image TIFF。导航到垂直位于左侧的 Batch Analysis 选项卡，用于对幻灯片进行批处理，然后在导出选项下选择为每个项目创建单独的目录。要添加幻灯片进行分析，请在 Add Slides 按钮下选择 QPTIFF 文件，然后将这些文件加载到批处理分析中。
选择 Run 以开始对幻灯片进行批处理。创建一个仅包含光谱解混中的组分文件的新文件夹，确保分层文件夹结构保持不变。启动整个幻灯片查看器软件。
单击左侧的 Create Project 并创建或选择具有适当名称的新空文件夹。然后单击 Automate 并选择 Show script editor （显示脚本编辑器）。复制并粘贴现有脚本，然后修改位置以将其定向到包含所有幻灯片组件文件的文件夹。
选择 Run 开始批量拼接幻灯片的过程，然后允许它完成。现在，将最近生成的 OME TIFF 文件移动到 QuPath 项目中，并将其另存为新项目。出现新窗口时，选择 将图像类型设置为荧光，然后单击 进口 按钮。
导航到左侧的菜单，从列表中选择一个样本，然后双击以打开所选样本。通过单击 Contrast 图标以增强可见性，从而调整通道的强度。选择所有频道并选择重置。
确保关闭自发荧光。要为肿瘤绘制感兴趣区域或 ROI，请再次单击对比度图标，然后选择 Show grayscale。之后，选择肿瘤标志物通道并调整强度以获得最佳可见性。
单击画笔工具以在肿瘤周围绘制 ROI。单击一个工具并调整 ROI，同时按 alt 键从外部平滑 ROI。完成后，将肿瘤的任何分离部分合并到相同的 ROI 中。
右键单击左侧列表中的 ROI 注释，选择 Set Properties ，然后提供合适的名称。例如，Tumor。通过选择 Objects （对象），然后选择 Annotations （注释），然后选择 Expand Annotations （扩展注释），从肿瘤区域扩展浸润切缘的 ROI。
为扩展半径选择所需的大小。选择 remove interior 和 constrain to parent。单击对比图标，选择自发荧光通道并调整强度以获得最佳可见度。
单击魔杖并调整 ROI，同时按下 alt 键从外部平滑 ROI 并删除任何不应属于此 ROI 的背景。右键单击左侧列表中的注释。然后选择 Set Properties 以为 ROI 分配合适的名称，例如侵入式边距或 IM。
如果需要，更改其颜色。要导出注释，请导航到 File 选项，单击 Object Data （对象数据）、Export as GeoJSON （导出为 GeoJSON），然后选择 Export All Objects （导出所有对象）。继续执行导出为要素集合时的默认选择，并将其保存在首选位置。
