从共培养物中回收交叉引发的 CD8 后，将其在 10 mL 完全生长培养基中以 1100 g 离心 10 分钟。在 100 μL 死细胞去除微珠中重悬 1 x 10 至 7 个细胞的幂次方，并在室温下孵育 15 分钟。将分离柱放入磁力分离器中，并用结合缓冲液冲洗。
将细胞悬液转移到分离柱中，并收集流出液。洗涤色谱柱后，收集通过的未标记细胞，并将其与先前收集的流出液混合。将以 1100 g 交叉引发的富集活 CD8 在完全生长培养基中离心 5 分钟。
计数后，在 12 孔板中以 2：1 的比例将 CD8 与新鲜 MCA205 细胞交叉引发培养，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 72 小时。在恢复 CD8 效应子之前，将莫能菌素和布雷菲德菌素添加到癌症免疫细胞共培养物中 6 小时。然后回收 CD8 效应子，并以 1100 g 离心两次，反应 5 分钟。
将细胞重悬于在低温 FACS 缓冲液中制备的三种不同的一抗混合物中，并在 4 摄氏度下避光孵育 20 分钟。将 100 微升 Mix C 中的固定液添加到细胞上颚中，并在 4 摄氏度下避光孵育 20 分钟。将细胞重悬于冷洗涤缓冲液中，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。
在 FACS 缓冲液中洗涤细胞两次后，向细胞沉淀中加入 100 微升含有 Vitality Fixable Aqua 染料的 PBS，持续 30 分钟。根据 FSCA 和 SSCA 特性识别感兴趣的细胞。然后绘制 FSCA 和 FSCH 图，以从分析中排除细胞双峰和团块。
绘制 525/50 纳米发射带通滤光片和 SSCA 以去除死细胞，使用 660/20 和 780/60 纳米发射带通滤光片，在两个参数密度图中检测 CDAA 和 CD3 的细胞阳性。此外，分析细胞中 CD44、CD25 和 CD69 标志物的 CD137 标志物，以及干扰素 γ 阳性和颗粒酶 B 分别检测混合物 A、B 和 C。对于肿瘤杀伤测定，用实时细胞死亡定量染料补充共培养培养基。
在活细胞分析系统中将板加热至 37 摄氏度后，每两小时执行一次数据扫描，最长 72 小时。将细胞以 1000 g 离心两次，持续 5 分钟。用 20 μL 冷 FACS 缓冲液对细胞表面标志物进行染色，并在 4 摄氏度下避光孵育 20 分钟。
然后加入活力染料碘化丙啶对细胞进行染色，以实现设门策略。根据 FSCA 和 SSCA 特性识别感兴趣的细胞。然后绘制 FSCA 和 FSCH 图，以从分析中排除细胞双峰和团块。
使用 450/50 纳米发射带通滤光片检测 CD45 阴性的癌细胞。在单参数直方图中，使用 610/620 纳米带通发射滤光片，分析细胞中碘化丙啶掺入的平均荧光强度。通过多参数流式细胞术，早期活化标志物 CD69 、晚期活化标志物 CD44 和 CD25 、 CD137 和 CD107 膜表达、肿瘤反应性标志物的表面表达水平得到增强。
细胞毒性分子、颗粒酶 B 和干扰素 γ 阳性的细胞内水平进行性显著增加，在共培养 72 小时时达到表达峰值。同源共培养的 MCA205 细胞经历了显着水平的 CD8 效应子介导的死亡。
