开发人卵巢上皮单层和类器官，用于研究再生和药物效应

首先，解冻冷冻保存的人卵巢表面上皮细胞。将细胞与 10 毫升洗涤介质混合。离心细胞后，将沉淀重悬于 2 毫升卵巢表面上皮或 OSE 2D 培养基中，并将其转移到 12 孔板的两个孔中。

在孔中加入 1 毫升额外的 OSE 2D 培养基，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳的加湿培养箱中培养 72 小时，然后第一次更新培养基。使用台盼蓝染色，使用自动细胞计数仪对新鲜分离或冻存的解冻活人卵巢表面上皮细胞进行计数。将所需数量的细胞混合到一毫升冰冷的 OSE 类器官基础培养基中，并以 240 G 离心管 5 分钟。

使用移液器，将细胞沉淀重悬于冰冷的未稀释基底膜提取物溶液中，以获得每 10 微升 10， 000 个细胞。在预热的多孔室载玻片中，每孔加入 10 微升 OSE 基底膜提取物溶液液滴，并将板在 37 摄氏度下倒置在含 5% 二氧化碳的加湿培养箱中 15 分钟。凝胶凝固后，加入 100 微升 OSE 3D 培养基，并在 37 摄氏度下在含 5% 二氧化碳的加湿培养箱中培养。

去除用过的培养基后，向每个孔中加入 100 微升冰冷的高级 DMEM F12。用 P1000 移液器吸头刮擦孔底部以分离凝胶液滴，并将每个漂浮的凝胶液滴转移到 1.5 毫升试管中。将试管以 240 G 离心 5 分钟。

弃去上清液后，将沉淀重悬于 300 μL 细胞解离缓冲液中，并将试管置于 37 摄氏度的预热珠浴中 5 至 10 分钟。接下来，加入 300 μL 人 OSE 类器官基础培养基，并以 240 G 离心 5 分钟。最后，将沉淀重悬于所需体积的未稀释基底膜提取物溶液中，以合适的比例重新接种用于培养。

原代人 OSE 细胞在第 3 代之前表现出鹅卵石样形态，但此后出现衰老迹象。培养 14 天后，来自新鲜分离的 OSE 细胞的人 OSE 类器官比来自 2D 扩增的 OSE 细胞的类器官长得更大。在 3D OSE 类器官中观察到各种形态，包括囊性、单层、多层和非腔化细胞簇。