我们要感谢所有为这项研究捐献组织的患者，感谢 Chuva de Sousa Lopes 小组的成员进行有益的讨论，感谢 I. De Poorter 设计了图 1 中使用的卡通。这项研究由欧洲研究委员会资助，资助号 ERC-CoG-2016- 725722 （OVOGROWTH） 用于 J.S.D.V. 和 S.M.C.d.S.L.;以及诺和诺德基金会 （reNEW），J.S.D.V. 和 S.M.C.D.S.L. 的资助编号NNF21CC0073729。

该研究是根据《赫尔辛基宣言》的指导方针进行的。研究设计已提交给莱顿大学医学中心 （LUMC） 的医学伦理委员会，并在研究前获得了无异议信 （B18.029）。使用的原代人类卵巢组织是从在 VUmc 医院（荷兰阿姆斯特丹）接受性别确认手术的跨男性人群中收集的。已获得所有捐献者签署的知情同意书。本协议中使用的所有材料均列在 材料表中。
1. 人原代 OSE 细胞分离
<ol><li>卵巢切除术后，将卵巢置于 0.9% NaCl 或类似的无菌盐水溶液中，并在冰上将其运送到实验室。</li>
	<li>将单个卵巢转移到含有 2-3 mL 消化培养基（表 1）或足以覆盖卵巢的 50 mL 锥形管中。 注意：如果卵巢不完整（器官的一部分已被切下以进行组织学分析），则至关重要的是不要用消化培养基覆盖这部分。</li>
	<li>将试管置于 37 °C 的预热珠浴（或水浴）中 30 分钟。</li>
	<li>小心地将卵巢转移到含有 10 mL 收集培养基的 60 mm 培养皿中（表 1）。</li>
	<li>使用细胞刮刀轻轻刮擦含有 hOSE 细胞的卵巢表面。在培养基中清洗刮刀并重复此步骤至少 3 次（图 1）。 注意：如果卵巢不完整，请避免刮擦和浸没受损区域，以尽量减少不需要的细胞类型的污染。</li>
	<li>将收集培养基中的 hOSE 细胞转移到 15 mL 试管中。</li>
	<li>将 hOSE 细胞以 240 x g 离心 5 分钟。<ol><li>如果沉淀呈红色，表明被红细胞 （RBC） 污染，则用 1 mL RBC 裂解缓冲液重悬沉淀。在室温 （RT） 下孵育 3 分钟，偶尔移液，加入 4 mL 含钙和镁 （PBS+/+） 的 PBS，然后以 240 x g 离心 5 分钟。如果红细胞持续存在，请重复此步骤。</li>
	</ol></li>
	<li>冷冻保存 hOSE 细胞沉淀（第 2 部分），将其用于 2D 培养（第 3 部分）或 3D 类器官（第 4 部分）（图 1）。</li>
</ol>2. hOSE 细胞的冻存-解冻
<ol><li>冻存<ol><li>将 hOSE 细胞沉淀重悬于 1 mL 细胞冷冻培养基中。</li>
		<li>将细胞悬液转移到冷冻管中（每个卵巢 2 个冷冻管）。</li>
		<li>将冻存管置于冷冻容器中，并在-80°C下放置过夜。</li>
		<li>将冷冻冻存管转移到液氮罐中长期储存。</li>
	</ol></li>
	<li>解冻：<ol><li>从液氮中取出冻存管。</li>
		<li>将冻存管置于 37 °C 的预热珠浴（或水浴）中 5 分钟，或直到冻存管内只可见一个小的冷冻核心。</li>
		<li>将 hOSE 细胞悬液移液到装有 10 mL 收集培养基的 15 mL 试管中（表 1）。</li>
		<li>以 240 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>将 hOSE 细胞沉淀用于 2D 培养（第 3 节）或 3D 类器官（第 4 节）。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 单层 2D hOSE 培养
<ol><li>将 hOSE 沉淀重悬于 1 mL OSE_2D 培养基中（表 1），并将其从 12 孔板转移到一个孔中。</li>
	<li>向孔中加入 1 mL 额外的 OSE_2D 培养基，并在 37 °C 的加湿培养箱 （5% CO2） 中培养 72 小时，以确保 hOSE 细胞在第一次更换培养基之前附着。</li>
	<li>每 2-3 天刷新一次培养基，直到 hOSE 细胞达到 70%-90% 汇合度 （P0）（图 2A）。 注意：如果培养物中仍然存在红细胞，它们将在第一次更换培养基时被去除，只有 hOSE 细胞将保持附着在孔中。</li>
	<li>对于传代 hOSE 细胞，请按照以下步骤操作。<ol><li>从孔中取出培养基。</li>
		<li>用 1 mL 无菌 PBS 洗涤。</li>
		<li>去除 PBS 并添加足够的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 以覆盖细胞。</li>
		<li>将板置于 37 °C 的加湿培养箱 （5% CO2） 中 4-7 分钟，直到注意到细胞聚集并从孔中分离。</li>
		<li>通过添加 1 mL 收集培养基终止酶促反应。</li>
		<li>收集 hOSE 细胞并以 240 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>以所需密度将细胞接种到新孔中，每 2-3 天刷新一次培养基，直到 hOSE 细胞达到 70%-90% 汇合，然后重复步骤 3.4。 注：原代 hOSE 细胞最多可培养 3 代。之后，大多数细胞会衰老（图 2A）。</li>
	</ol></li>
	<li>使用扩增的 hOSE 细胞使用免疫荧光（图 2B）进行进一步表征，以测试培养基（图 2C）或 3D 类器官（第 4 节）的效果。</li>
</ol>4. 3D hOSE 类器官培养
<ol><li>在 37 °C 下预热多孔室载玻片。</li>
	<li>使用自动细胞计数器或用血细胞计数器手动计数（新鲜分离或冻融）hOSE 细胞。</li>
	<li>将所需数量的 hOSE 细胞重悬于 1.5 mL 试管中的 1 mL 冰冷 OSE 类器官基础培养基（表 1）中。</li>
	<li>以 240 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将 hOSE 沉淀重悬于所需量的冰冷未稀释的基底膜提取物 （BME） 溶液中，以获得 1 x 104 个细胞/10 μL BME 的细胞浓度。</li>
	<li>上下移液 hOSE-BME 溶液以确保均匀分布。</li>
	<li>在预热的多孔室载玻片中每孔制备 10 μL hOSE-BME 溶液液滴。 注：确保每个液滴都位于孔的中心，以获得液滴形状。</li>
	<li>将带有液滴的板在 37 °C 下倒置在加湿培养箱 （5% CO2 ） 中 15 分钟，以使凝胶凝固。</li>
	<li>加入 100 μL OSE_3D培养基（表 1），并在 37 °C 下在加湿培养箱（5% CO2 ）中培养。</li>
	<li>每 3-4 天刷新一次培养基。 注意：hOSE 类器官在培养物中至少持续生长至 28 天（图 3A、B），但建议每 14-28 天传代一次（生长速率取决于供体，新鲜与冷冻 hOSE）以刺激细胞增殖和类器官存活。3 个独立的 hOSE 类器官细胞系至少传代 4 次，无衰老迹象。hOSE 类器官显示出不同的形态（图 3C）。</li>
	<li>对于传代 hOSE 类器官：<ol><li>去除培养基，向每个孔中加入 100 μL 冰冷的高级 DMEM/F12。</li>
		<li>用 P1000 移液器吸头刮擦孔的底部以分离凝胶液滴。</li>
		<li>将每个漂浮的凝胶液滴转移到 1.5 mL 试管中。</li>
		<li>将带有凝胶液滴的试管以 240 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>去除上清液，将沉淀重悬于 300 μL 细胞解离缓冲液中，并将试管置于 37 °C 的预热珠浴（或水浴）中 5-10 分钟。 注意：如果某些类器官保持完整，请用胎牛血清包被的冰冷移液管尖端上下移液几次，以机械方式破坏它们。用胎牛血清涂布移液管吸头可防止类器官粘附在吸头上。</li>
		<li>加入 300 μL hOSE 类器官基础培养基，并以 240 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于所需量的未稀释 BME 溶液中，以合适的比例重新接种（将 1 滴的内容物分配到 1-4 个液滴中），并如上所述进行培养。 注意：类器官未解离成单个细胞，因此，无法准确计数细胞以进行进一步传代。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 3D hOSE 类器官的整装免疫荧光
注：如果使用适用于显微镜技术的多孔室载玻片，则可以在同一培养孔（在液滴中）进行整体免疫荧光。
<ol><li>在 RT 下将液滴中的 hOSE 类器官固定在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中 20 分钟。</li>
	<li>在 RT 下在旋转/摇动平台上用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在 RT 下使用 100 μL 透化缓冲液（表 1）透化液滴中的 hOSE 类器官 15 分钟。</li>
	<li>在 RT 下用 100 μL 封闭缓冲液（表 1）洗涤 3 次，持续 15 分钟，然后在 4 °C 下在旋转/摇动平台上封闭过夜 （o/n）。</li>
	<li>在 4 °C o/n 下与用封闭缓冲液稀释的 100 μL 一抗混合物在旋转/摇动平台上孵育。 注：有关使用的一抗列表、标记的细胞类型以及用于验证表达12、19、20、21、22、23、24、25 的动物模型，请参见材料表。</li>
	<li>将板置于 RT 中，并在旋转/摇动平台上用 100 μL 封闭缓冲液在 RT 上洗涤 3 次，每次 15 分钟。</li>
	<li>在 RT 中，在旋转/摇动平台上与 100 μL 稀释在封闭缓冲液中稀释的二抗混合物孵育 2 小时，但避光。 注：有关使用的二抗列表，请参阅 材料表 。为了避光，请将板放在暗盒中或用铝箔覆盖。</li>
	<li>在 RT 下在旋转/摇动平台上用 100 μL PBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟。</li>
	<li>将板储存在 4 °C 下，用铝箔覆盖直至成像（图 4）。</li>
</ol>6. hOSE 类器官大小的定量
<ol><li>在显微镜上拍摄 10 倍明场照片（TIFF 图像）。</li>
	<li>下载并安装斐济 （https://imagej.net/software/fiji/）26。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件斐济测量 hOSE 类器官图像区域：<ol><li>在斐济加载图像 TIFF 文件。</li>
		<li>通过单击 图像>调整阈值，为软件创建一个阈值，以识别上传的明场图像中的 hOSE 类器官（较暗的区域>。调整 below 和 above 的值，直到去除大部分背景并保留单个类器官。</li>
		<li>通过单击 Analyze > Tool > ROI 打开 ROI 工具。</li>
		<li>选择 Wand 工具并单击带有 hOSE 类器官的区域，直到看到整个类器官周边有一条黄线。在 ROI 面板中，单击 Add and Measure 以获取该 OSE 类器官的面积值。</li>
		<li>重复步骤 6.3.4。对于每个要测量的 hOSE 类器官。</li>
	</ol></li>
</ol>

人卵巢上皮类器官：组织修复和药物检测模型

3D 类器官技术正在成为医学研究中不可或缺的工具。一方面，这个体外平台提供了研究有关组织再生、伤口愈合和发育的基本机制问题的可能性18。另一方面，来自患者样本的 3D 类器官允许个性化医学研究，包括诊断、药物检测和细胞治疗 12,13,14,37,38。在卵巢研究领域，hOSE 自从被认为是上皮性卵巢癌的起源以来，引起了人们的极大兴趣39。尽管人们认为大多数高级别浆液性卵巢癌 （HGSOC） 是最常见的上皮性卵巢癌之一，起源于输卵管40，但目前对小鼠 3D 卵巢类器官的研究提出了 HGSOC 可能起源于 OSE 和输卵管15,16。
在这里，我们描述了一种衍生 hOSE 3D 类器官的方案，并概述了其在卵巢组织再生中引入新机制知识的应用。该协议包括一种从人卵巢中分离原代 hOSE 细胞并生成 3D hOSE 类器官的分步方法。为了确保有效的 hOSE 类器官衍生，尽量减少卵巢操作至关重要。由于其位于卵巢表面和单层组织，hOSE 在卵巢切除术和器官操作过程中容易损伤和丢失。出于这个原因，我们赞成将酶和刮擦方法应用于整个卵巢以分离 hOSE 2,8。在本方案中，采用温和的酶处理以破坏 hOSE 细胞间连接，然后轻轻刮擦卵巢表面。
将 2D 与 3D hOSE 培养进行比较，重要的是要注意，尽管 2D 培养中 hOSE 细胞的初始增殖率很高，但它们的细胞特征因 EMT 而改变，这表明应用的 2D 培养条件不适合维持上皮形态。相比之下，3D hOSE 类器官可以传代至少 4 次而没有衰老迹象。使用的类器官培养基OSE_3D基于 Kopper 及其同事用于衍生 OC 和健康 hOSE 类器官12 以及 Kessler 及其同事用于衍生人类 FT 类器官17 的培养基。主要区别在于用市售重组蛋白替代人 Wnt3a 和 R-Spondin-1 条件培养基，以提高可重复性。
免疫荧光技术通常包括从培养板中取出组织样本，并将其处理以进行石蜡或冷冻切片。当处理非常小的结构时，在样品处理过程中丢失它们的风险很高。在该方案中，hOSE 类器官的衍生发生在细胞培养板中，允许直接显微镜成像，而无需从 BME 基质中去除 hOSE 类器官。此外，Rezanejad 及其同事描述的胰腺导管类器官41 中使用的整装免疫荧光方法能够 原位 观察形态完整的类器官内的蛋白质定位。我们证明，当对多孔室载玻片中衍生的 hOSE 类器官执行这种免疫荧光方案时，抗体渗透效率高，背景信号非常低。
尽管使用该方法衍生的大多数 hOSE 类器官缺乏 CDH1 表达，但形成了一些 CDH1+ hOSE 类器官，与 CDH1-hOSE 类器官相比，其尺寸更大。CDH1 的表达与肿瘤性 hOSE 表型 2,35 有关。用于 hOSE 分离的卵巢由育龄 （27.1 ± 5 岁的健康跨性别男性供体） 捐赠。这些供体在卵巢切除术前接受了 38 ± 15 个月的睾酮治疗。我们不能排除卵巢表面的 CDH1 + hOSE 细胞可能归因于睾酮治疗的可能性。尽管雄激素治疗与卵巢变化有关，例如无排卵42、皮质区域增生43 和皮质硬度增加44，但在使用睾丸激素时一般卵巢病变仍然是良性的45。
总之，该协议强调了生成 hOSE 3D 类器官以解码有关卵巢组织再生的机制问题的潜力。重要的是，该方法也可用于检测有癌症发展风险患者的卵巢活检中存在的恶性细胞。总的来说，该方法支持这种创新的 体外 平台在基本卵巢功能和个体化医学治疗的临床应用方面的潜在应用。

卵巢被认为是体内最具活力的器官之一，在个体的整个生殖生命周期中，它不断经历伤口愈合和重塑的循环。参与每个排卵周期后卵巢组织再生的主要参与者是卵巢表面上皮 （OSE）1。OSE 是间皮衍生的单层，包含覆盖整个卵巢表面的扁平、长方和柱状上皮细胞2。排卵前，排卵卵泡表面的卵巢基质组织发生蛋白水解破坏，以允许卵丘-卵母细胞复合物释放。然后修复受伤区域，称为排卵柱头，小鼠在不到 72 小时内实现卵巢表面完全闭合3。OSE 增殖和闭合排卵伤口的高效能力突出了常驻干细胞群的假定存在4。由于育龄捐献者提供的人类卵巢有限，因此有关 OSE 修复机制的大部分知识都来自动物模型。然而，物种特异性特征阻碍了从基于动物的卵巢研究到人类的转化5。
体外研究主要使用人 OSE 的二维 （2D） 细胞培养，由于其成本效益和易于培养，细胞在附着在培养板表面的单层中生长 6,7,8。尽管如此，这种方法在复制卵巢组织动力学的复杂性方面存在局限性9。在这方面，特别关注卵巢类器官的 3D 细胞培养平台彻底改变了卵巢研究10。组织类器官是它们来源器官的体外微型表示，表现出 3D 自组织能力并模拟其体内对应物的关键功能和结构11。这项技术为阐明有关人类卵巢发育、再生和组织修复的基本问题提供了可能性10.近年来，研究人员还将卵巢类器官的知识应用于生成患者特异性卵巢癌 （OC） 类器官，用于疾病建模和个性化医疗 12,13,14。
基于用于生成小鼠 OSE 类器官和输卵管 （FT） 类器官15,16 以及人类 OSE 类器官12 和 FT 类器官17 的不同方法，我们在这里描述了一种从人类卵巢衍生人类 OSE 类器官的方案，在 OSE 再生研究中具有潜在应用。该方案有效地从整个人类卵巢中分离原代 OSE 细胞，并包括 2D 细胞扩增和 3D hOSE 类器官生成的分步描述。hOSE 类器官在形态和生长方面表现出（供体特异性）变异性，突出了它们在个性化研究中的效用。此外，该方案包括同一培养板内的 hOSE 类器官维持、传代和免疫荧光。此外，它描述了 hOSE 类器官可以采用的不同形态，并表征了培养过程中免疫表型的变化。最后，它通过研究环境线索（如卵巢激素）对基于 hOSE 类器官数量和大小对 hOSE 类器官形成和生长的影响来展示实用性。
hOSE 类器官技术的应用将增强我们对卵巢的理解，特别强调负责其显着再生能力的机制。随着 3D 人类卵巢模型的不断发展，卵巢研究中对动物模型的依赖将减少，从而导致再生医学领域的创新疗法18。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3336</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28cm Cell Scraper</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>541070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227261</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead bath</td>
			<td></td>
			<td>M714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-container &#34;Mr. Frosty&#34;</td>
			<td>BD Falcom</td>
			<td>479-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A-21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A-21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Sheep IgG Alexa Flour 647&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A-21448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A4736401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle Stimulating Hormone (FSH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>6652995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CDH2 (N/R-cadherin)</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>SC-1502</td>
			<td>Mesenchymal Cells; Wong et al 1999 (human)25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-PODXL (podocalyxin of GP135)</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>AF1658</td>
			<td>Apical Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>263-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X; 100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH Research Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4736401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna-II&#160; cell counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26600-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ITGB1 (integrin beta 1)</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>SC-53711</td>
			<td>Basolateral Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-KRT8 (cytokeratin 8)</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>SC-101459</td>
			<td>OSE Cells; Kopper et al 2019 (human)12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-VIM (vimentin)</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>AB0809</td>
			<td>Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycozap Plus-CL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V2A-2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVITRELLE-Choriogonadotropin alfa (hCG)</td>
			<td>Merk</td>
			<td>G03GA08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone&#160;(P4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ACTA2 (alpha smooth muscle actin)</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>AB5694</td>
			<td>Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-CDH1 (E-cadherin)</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>CST 3195S</td>
			<td>Epithelial Cells; Wong et al 1999 (human)25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LGR5</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td>AB75850</td>
			<td>OSE Progenitor Cells; Flesken-Nikitin et al 2013 (mouse)22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-YAP</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>14074S</td>
			<td>Proliferative OSE; Wang et al 2022 (mouse)24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CD44 PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0441-81</td>
			<td>OSE Progenitor Cells; Bowen et al 2009 (human)20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Heregulin&#946;-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rspondin-1&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells lysis buffer</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revitacell Supplement (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A26445-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free DNAse</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1624/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-COL1A1 (pro-collagen 1 alpha 1)</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>AF6220</td>
			<td>Mesenchymal Cells; Hosper et al 2013 (human)23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632&#160;</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Estradiol (E2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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human ovarian surface epithelium organoids as a platform to study tissue regeneration

卵巢表面上皮 （OSE） 是卵巢的最外层，在每次排卵期间都会破裂，在恢复卵巢完整性的同时在卵巢伤口愈合中起着至关重要的作用。此外，OSE 可能是上皮性卵巢癌的来源。尽管 OSE 再生特性已在小鼠中得到充分研究，但由于进入人类卵巢和合适的 体外 培养方案有限，仍然阻碍了了解人类卵巢组织修复的确切机制。组织特异性类器官是复制原始器官结构和功能方面的小型化 体外 模型，为研究器官生理学、疾病建模和药物测试提供了新的机会。 
在这里，我们描述了一种从整个卵巢中分离原代人 OSE （hOSE） 并建立 hOSE 类器官的方法。我们包括显示供体之间异质性的形态学和细胞特征。此外，我们证明了这种培养方法在 2 周内评估激素对 OSE 类器官生长影响的能力。这种方法可能有助于发现导致 OSE 再生的因素，并有助于针对恶性 OSE 的患者特异性药物筛查。

The ovary is considered one of the most dynamic organs in the body, undergoing constant cycles of wound healing and remodeling throughout the reproductive lifespan of the individual. A main player involved in the regeneration of ovarian tissue after each ovulatory cycle is the ovarian surface epithelium (OSE)1. The OSE is a mesothelium-derived single layer containing flat, cuboidal, and columnar epithelial cells that cover the entire ovarian surface2. Prior to ovulation, the ovarian stromal tissue on the surface of the ovulatory follicle undergoes proteolytic disruption to allow the release of the cumulus-oocyte complex. The wounded area, known as the ovulatory stigma, is then repaired, with complete closure of the ovarian surface achieved in less than 72 hours in mice3. The highly efficient capacity of the OSE to proliferate and close the ovulatory wound highlights the putative existence of a resident stem cell population4. Due to the limited availability of human ovaries from donors of reproductive age, most of the knowledge on the mechanisms of OSE repair comes from animal models. However, species-specific features hamper the translation from animal-based ovarian research to humans5.
In vitro studies have predominantly used 2-dimensional (2D) cell culture of human OSE, whereby cells grew in a monolayer attached to the surface of a culture plate, due to its cost-effectiveness and easy culture6,7,8. Nonetheless, this approach has limitations replicating the complexity of the ovarian tissue dynamics9. In this regard, 3D cell culture platforms with a special focus on ovarian organoids have revolutionized ovarian research10. Tissue organoids are miniaturized in vitro representations of the organ they are derived from, exhibiting 3D self-organization capacity and mimicking key functions and structures of their in vivo counterparts11. This technology offers the possibility to shed light on fundamental questions regarding development, regeneration, and tissue repair in the human ovary10. In recent years, researchers have also applied knowledge on ovarian organoids for the generation of patient-specific ovarian cancer (OC) organoids for disease modeling and personalized medicine12,13,14.
Based on different methods used for the generation of mouse OSE organoids and fallopian tube (FT) organoids15,16 as well as human OSE organoids12 and FT organoids17, we describe here a protocol for the derivation of human OSE organoids from human ovaries with potential applications in OSE regeneration studies. This protocol efficiently isolates primary OSE cells from whole human ovaries and includes a step-by-step description of 2D cell expansion and 3D hOSE organoid generation. The hOSE organoids displayed (donor-specific) variability in morphology and growth, highlighting their utility for personalized studies. Additionally, this protocol includes hOSE organoid maintenance, passaging, and immunofluorescence within the same culture plate. Furthermore, it provides a description of the different morphology that hOSE organoids can adopt and characterizes changes in immunophenotype during culture. Lastly, it showcases utility by investigating the influence of environmental cues, such as ovarian hormones, on hOSE organoid formation and growth based on hOSE organoid number and size.
The application of hOSE organoid technology will enhance our understanding of the ovary, with a specific emphasis on the mechanisms responsible for its remarkable regenerative capacity. As 3D human ovarian models continue to evolve, the reliance on animal models in ovarian research will decrease, leading to innovative therapies in the field of regenerative medicine18.

作者聚焦：使用表面上皮类器官推进人类卵巢修复和癌症研究

人卵巢表面上皮类器官作为研究组织再生的平台

Our research focuses on understanding the ovarian function in humans. Due to the still present knowledge gap in female reproductive health, as well as the increasing need for new technology to treating fertility, we aim to study ovarian processes, such as folliculogenesis, or tissue regeneration in order to promote the development of new clinical protocols. In recent years, we have witnessed great advances in 3D tissue culture protocols.These developments have enabled the formation of, for instance, artificial ovaries, which are follicle like structures, capable of supporting the maturation of an all site full image. Additionally, we are also seeing how organoids or tumoroids, which are miniaturized version of an organ or a tissue, we are seeing how they are paving the way for further studies on ovarian biology and diseases. Access to ovarian samples coming from donors in reproductive age still represents a big challenge.On top of that, results obtain when using this material show a high inter donor viability, most likely due to factors such as differences in donor's age, metabolic state, and endocrine function. Altogether, this heterogeneity makes it difficult to reproduce results and to translate the protocols into the clinic. Despite that the ovaries stand out as one of the most dynamic and changing organs within the body it's regenerative mechanisms are still very poorly understood.And actually, most of the knowledge obtained so far still comes from animal models. With our OSC organoid protocol, we provide a platform to study the role of the human OSC layer in ovarian tissue regeneration and wound healing. Compared to others our protocol has been designed based on the use of non-pathological samples.This allow its application in developmental studies that are trying to find answers to fundamental mechanistic questions about the ovarian function in humans.

2D hOSE 培养 将新鲜分离的 hOSE 细胞接种在 12 孔板上并培养 3 周。在此期间，细胞传代 3 次（图 2A）。根据之前报告有限期 hOSE 可以传代27 的结果，培养中的原代 hOSE 细胞在第 3 代 （P3） 之前表现出鹅卵石样形态，但此后开始出现衰老迹象。此外，小鼠 OSE 已被证明 在体外经历上皮-间充质转化 （EMT），表现出成纤维细胞样特征，例如肌动蛋白细胞骨架的重排和胶原蛋白 I的沉积 19。一致，ACTA2 + CD44 + hOSE 显示 P2 和 P3 之间 COL1A1 的显着上调（图 2B），表明 hOSE 细胞在培养过程中经历 EMT。
TGF-β 信号转导是 EMT 的主要调节因子28，能够在各种上皮细胞类型中诱导 EMT29。虽然 TGF-β 未添加到OSE_2D培养基中，但添加的 FBS 可能含有可检测水平的这种细胞因子30,31。出于这个原因，我们测试了添加 TGF-β 抑制剂 I 型受体 SB-431542 是否可以预防 EMT，从而延长 2D 培养时间。令人惊讶的是，在 OSE_2D 培养基中补充 10 μM SB-43154232阻碍了细胞增殖（图 2C）。我们得出结论，TGF-β 信号传导对 OSE 增殖至关重要，并在没有抑制剂的情况下进行了进一步的 2D 培养实验。
3D hOSE 类器官培养 根据已发表的培养条件培养人 OSE 类器官12，我们衍生了嵌入 BME 液滴中的hOSE类器官，并在培养基（含有标准浓度的 100 nM 雌二醇）中生长长达 20 天OSE_3D。在 7 天内，许多来自新鲜分离的 OSE 细胞的 hOSE 类器官是囊性的，平均直径为 130 毫米（图 3A，B）。这些结果与 Kopper 及其同事报道的从切碎和酶消化的人卵巢组织中提取 hOSE 类器官的结果相似12。有趣的是，来自新鲜分离的 OSE 细胞的 hOSE 类器官在培养 14 天后比来自 2D 扩增的 OSE 细胞的 hOSE 类器官（平均直径为 100 mm）长得更大（平均直径为 100 mm）（图 3B），可能是由于 2D 扩增的 OSE 细胞倾向于减少增殖。此外，虽然许多 3D hOSE 类器官由单层扁平上皮细胞组成（图 3C 左上图），但一些表现出立方体单层细胞（图 3C 右上图），其他是多层的（图 3C 右下图）或形成非发光细胞簇（图 3C 左下图）。
为了测试是否可以使用OSE_2D培养基衍生 hOSE 类器官，将新鲜分离的 hOSE 细胞包埋在 BME 液滴中，并在OSE_2D培养基中生长 12 天。6 天后，可见梭形细胞，表明 hOSE 细胞在液滴中接受 EMT。重要的是，使用OSE_2D培养基没有形成 hOSE 类器官（图 3D）。
hOSE 类器官的细胞特征 在人类成人卵巢中，角蛋白 8 （KRT8） 特异性标记 OSE 群体（图 4A），因此，hOSE 类器官保留了 KRT8 表达，验证了它们的细胞身份（图 4B）。在小鼠 OSE 细胞中，Yes1 相关蛋白 （YAP1） 的核定位与排卵后能够扩增和愈合受伤区域的 OSE 干细胞/祖细胞特异性相关24,33。YAP 显示 hOSE 类器官的大多数细胞中的核定位与它们的大小无关（图 4B）。还研究了据报道在小鼠 OSE 细胞中表达的其他标志物，例如 CD4420 和 LGR522。有趣的是，CD44 和 LGR5 都在小的 hOSE 类器官（直径<100 μm）中表达，而在较大的类器官中，CD44 和 LGR5 似乎下调（图 4B）。
接下来，我们研究了 hOSE 类器官是否显示出通常在 BME 包埋的类器官 （apical-in）中观察到的顶端-基底极性34。基底外侧蛋白整合素 β 1 （ITGB1） 和顶端蛋白足萼素 （PODXL） 用于显示 hOSE 类器官中的细胞极性，证实了独立于 hOSE 类器官大小的清晰顶端极性（图 4B）。
已知人 OSE 表达间充质标志物 N-钙粘蛋白 （CDH2），而上皮标志物 E-钙粘蛋白 （CDH1） 的表达仅限于柱状 OSE 细胞（图 4A）2。有趣的是，这项工作中衍生的 hOSE 类器官表达间充质标志物 CDH2 和 vimentin （VIM），而具有长方体/柱状上皮细胞的大囊性 hOSE 类器官都是 CDH1 + 和 CDH2 + VIM + （图 4C）。目前尚不清楚 CDH1+ hOSE 类器官是来源于原代 CDH1+ OSE 细胞，还是来源于体外经历上皮分化或（肿瘤）转化的 CDH1-OSE 细胞 25,35。
展示 hOSE 类器官的使用：排卵线索对 hOSE 类器官的影响 促卵泡激素和人绒毛膜促性腺激素可用于诱导卵泡生长和排卵，而排卵后，卵巢产生的激素（如黄体酮和雌二醇36）的浓度显着增加。为了展示 hOSE 类器官作为筛选平台的可用性，我们使用类器官的数量和大小作为定量输出（使用斐济），检查了这些激素对 hOSE 类器官的影响。为此，我们在缺乏雌二醇（无激素）OSE_3D培养基和含有不同浓度的 FSH、hCG、雌二醇或孕酮的OSE_3D培养基中衍生了 hOSE 类器官（图 5A）。
培养 7 天后，对来自来自 3 个不同供体 （n=3） 的冻融（未扩增）hOSE 细胞衍生的 hOSE 类器官的数量进行定量（图 5A、B）。培养基每 3 天更换一次。与不含激素的培养基相比，在含有激素的培养基中形成的每滴 hOSE 类器官总数未观察到显著差异（图 5A、B）。为了量化激素对类器官大小的影响，培养 14 天后，对每个液滴（来自每种条件）进行成像，并使用 Fiji 测量 4 个最大的 hOSE 类器官的面积。有趣的是，在黄体酮 （1000 nM） 或雌二醇 （200 nM） 存在下，从两个不同的供体 （n = 2） 产生 hOSE 类器官导致每个液滴至少产生一个非常大的类器官（直径约 700 μm）（图 5C，D）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig01.jpg"> 图 1：从整个卵巢中分离 hOSE 细胞的示意图。 将卵巢在 37 °C 下在消化液中孵育 30 分钟。通过轻轻刮擦将 hOSE 细胞从卵巢表面分离，随后冷冻保存，直接接种在单层 2D OSE 培养物上，或包埋在基底膜提取物 （BME） 中用于 3D hOSE 类器官培养。冻存解冻的 hOSE 细胞可用于 2D 培养或 3D 类器官形成，2D 扩增的 hOSE 细胞可用于生成 3D hOSE 类器官。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig02.jpg"> 图 2：hOSE 细胞的 2D 原代培养物。 （A） hOSE 细胞在第 0 次 （P0） 、第 2 次 （P2） 和第 3 次 （P3） 传代时的明场图像，描绘了典型的上皮鹅卵石形态。比例尺在顶部面板上为 750 μm，在底部面板上为 125 μm。（B） P2 和 P3 处 2D hOSE 细胞上 ACTA2、CD44、COL1A1 的免疫荧光。比例尺为 50 μm。（C） 用 10 μM SB-431542 在 P0、P2 和 P3 培养的 hOSE 细胞的明场图像。细胞从 P2 开始出现衰老迹象，并且在培养过程中没有达到高汇合度。比例尺在顶部面板上为 750 μm，在底部面板上为 125 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig03.jpg"> 图 3：hOSE 类器官的形态学特征。 （A） 来自三个不同供体（tOVA86、tOVA87、tOVA88）的三个独立 hOSE 类器官衍生物的明场图像。在细胞包埋 （D0） 、第 7 天 （D7） 、第 14 天 （D14） 和第 28 天 （D28） 后拍摄图像。比例尺在 D0 处为 750 μm，其余为 50 μm。（B） 来自新鲜分离的 hOSE 细胞（虚线）和 2D 扩增的 hOSE 细胞（实线）的 hOSE 类器官的直径。所描绘的是± D0、D7 和 D14 处测量的平均大小和标准差。显示了两个不同供体 （tOVA88 和 tOVA89） 的结果。（C） 显示不同形态的 hOSE 类器官的明场图像：单平面层（左上）、单柱状层（右上）、多层（右下）和非发光细胞聚集体（左下）。比例尺为 100 μm。（D） 包埋在 BME 中并与 OSE_2D 培养基培养 12 天的 hOSE 细胞的明场图像。在细胞包埋 （D0） 、第 6 天 （D6） 、第 9 天 （D9） 和第 12 天 （D12） 后拍摄图像。成纤维细胞样细胞取代了培养物，没有形成类器官样结构。比例尺为 750 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig04.jpg"> 图 4：hOSE 类器官的细胞表征。 （A） 人卵巢切片中 KRT8 和 CDH1 的免疫荧光。左图的比例尺为 500 μm，中间和右图为 50 μm。（B） 不同大小（<50 μm、50-75 μm、75-100 μm、>100 μm）的 hOSE 类器官中 KRT8 和 YAP、LGR5 和 CD44 以及 ITGB1 和 PODXL 的免疫荧光。比例尺为 50 μm。（C） hOSE 类器官中 VIM、CDH1、CDH2 的免疫荧光。比例尺为 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig05.jpg"> 图 5：排卵线索对 hOSE 类器官形成的影响。 （A） 在不同培养基中第 7 天形成的每个液滴的 hOSE 类器官总数。hOSE 类器官来源于三个不同的供体 （tOVA77 、 tOVA79 、 tOVA83）。粗体是用于类器官衍生的OSE_3D培养基。（B） 与不含激素的培养基相比，相对类器官形成。来自 hOSE 类器官的合并值来自三个不同的供体 （tOVA77 、 tOVA79 、 tOVA83）。（C） 图表描绘了在两个不同供体 （tOVA77、tOVA83） 测试的每个实验条件下第 14 天 4 个最大的 hOSE 类器官的图像区域。（D） 明场图像显示 hOSE 类器官在第 14 天培养时，使用不含激素的培养基，来自两个不同供体（tOVA77、tOVA83）的 200 nM E2 和 1000 nM P4。比例尺为 750 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig05large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
表 1：研究中使用的工作溶液的组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

该协议描述了从原代人卵巢表面上皮 （hOSE） 细胞建立三维 （3D） 组织类器官。该方案包括从新鲜收集的卵巢中分离 hOSE、hOSE 的细胞扩增、冷冻保存-解冻程序和类器官衍生。包括免疫荧光、定量分析和作为筛选平台的展示实用程序。

The ovarian surface epithelium (OSE), the outermost layer of the ovary, undergoes rupture during each ovulation and plays a crucial role in ovarian wound ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Human Ovarian Surface Epithelium Organoids as a Platform to Study Tissue Regeneration

609 次观看.  Leiden University Medical Center. 我们的研究重点是了解人类的卵巢功能。由于女性生殖健康方面仍然存在知识差距，以及对治疗生育能力的新技术的需求日益增加，我们的目标是研究卵巢过程，例如卵泡生成或组织再生，以促进新临床方案的开发。近年来，我们见证了 3D 组织培养方案的巨大进步。这些发展使得人工卵巢的形成成为可能，例如，人工卵巢是卵泡状结构，能够?...

视频: 作者聚焦：使用表面上皮类器官推进人类卵巢修复和癌症研究

The ovarian surface epithelium (OSE), the outermost layer of the ovary, undergoes rupture during each ovulation and plays a crucial role in ovarian wound healing while restoring ovarian integrity. Additionally, the OSE may serve as the source of epithelial ovarian cancers. Although the OSE regenerative properties have been well studied in mice, understanding the precise mechanism of tissue repair in the human ovary remains hampered by limited access to human ovaries and suitable in vitro culture protocols. Tissue-specific organoids, miniaturized in vitro models replicating both structural and functional aspects of the original organ, offer new opportunities for studying organ physiology, disease modeling, and drug testing. 
Here, we describe a method to isolate primary human OSE (hOSE) from whole ovaries and establish hOSE organoids. We include a morphological and cellular characterization showing heterogeneity between donors. Additionally, we demonstrate the capacity of this culture method to evaluate hormonal effects on OSE-organoid growth over a 2-week period. This method may enable the discovery of factors contributing to OSE regeneration and facilitate patient-specific drug screenings for malignant OSE.

This protocol describes establishing three-dimensional (3D) tissue organoids from primary human ovarian surface epithelium (hOSE) cells. The protocol includes isolation of hOSE from freshly collected ovaries, cellular expansion of the hOSE, cryopreservation-thawing procedures, and organoid derivation. Immunofluorescence, quantitative analysis, and showcasing utility as a screening platform are included.

科研

发育生物学

Human Primary Ovarian Surface Epithelial Cell Isolation for Obtaining Organoids for In Vitro Tissue Studies

To begin, transport human ovaries to the lab in 0.9%sodium chloride, or similar sterile saline solution on ice. Rinse ovaries with fresh, cold saline solution in a Petri dish. Transfer each ovary to a 50 milliliter conical tube, and add two to three milliliters of digestion medium to cover the ovary.Place the tube in a bead bath, tempered at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Then carefully transfer the ovary into a 60-millimeter Petri dish containing 10 milliliters of collection medium. Using a cell scraper, scuff the ovarian surface containing the human ovarian surface epithelial cells, gently.Wash the scraper in the medium before scraping at least two more times. Transfer the human ovarian surface epithelial cells in the collection medium into a 15-milliliter tube. Spin down the cells at 240G for five minutes.If the pellet shows a red color indicative of contamination with red blood cells, resuspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer. Then, add four milliliters of PBS with calcium and magnesium, and centrifuge at 240G for five minutes. Cryo-preserve the human ovarian surface epithelial cell pellet for future culture use.

人原代卵巢表面上皮细胞分离，用于获得用于体外组织研究的类器官

Developing Human Ovarian Epithelium Monolayer and Organoids for Studying Regeneration and Drug Effects

To begin, thaw cryopreserved human ovarian surface epithelial cells. Mix the cells with 10 milliliters of washing medium. After centrifuging the cells, resuspend pellet in two milliliters of ovarian surface epithelium or OSE 2D medium and transfer it into two wells of a 12-well plate.Add one milliliter of extra OSE 2D medium into the well and culture at 37 degrees Celsius in a humidified incubator with 5%carbon dioxide for 72 hours before the first media renewal. Employ Trypan Blue staining to count freshly isolated or cryopreserved thawed live human ovarian surface epithelial cells with an automated cell counter. Mix the desired number of cells in one milliliter of ice cold OSE organoid basic medium, and centrifuge the tube at 240 G for five minutes.Using a pipette, resuspend the cell pellet in ice cold undiluted basement membrane extract solution to obtain 10, 000 cells per 10 microliters. Add 10 microliter droplets of OSE basement membrane extract solution per well in a pre-warmed multi-well chambered slide and place the plate upside down at 37 degrees Celsius in a humidified incubator with 5%carbon dioxide for 15 minutes. After the gel solidifies, add 100 microliters of OSE 3D medium and culture at 37 degrees Celsius in a humidified incubator with 5%carbon dioxide.After removing the spent medium, add 100 microliters of ice cold advanced DMEM F12 to each well. Scrape the bottom of the wells with a P1000 pipette tip to detach the gel droplets and transfer each floating gel droplet to a 1.5 milliliter tube. Centrifuge the tube at 240 G for five minutes.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 300 microliters of cell dissociation buffer and place the tubes in a pre-warmed bead bath at 37 degrees Celsius for 5 to 10 minutes. Next, add 300 microliters of human OSE organoid basic medium, and centrifuge at 240 G for five minutes. Finally, resuspend the pellet in the desired volume of undiluted basement membrane extract solution to reseed them at a suitable ratio for culturing.Primary human OSE cells exhibited cobblestone-like morphology up to passage three, but showed signs of senescence thereafter. Human OSE organoids from freshly isolated OSE cells grew larger than those from 2D expanded OSE cells after 14 days in culture. Various morphologies were observed in 3D OSE organoids, including cystic, monolayer, multilayered, and non-lumenized cell clusters.