首先,取在 T25 培养瓶中生长的神经元进行共培养。用 5 毫升含有胰蛋白酶和 Dnase I. 的 versene 溶液替换培养基,加入 0.5 毫升胎牛血清以中和胰蛋白酶和 Dnase I.将细胞转移到 15 毫升锥形管中。用 5 毫升完全 neurobasal 培养基洗涤培养瓶一次,以最大限度地增加收集的神经元。
然后,在 4 摄氏度下以 300 G 离心细胞悬液 5 分钟。弃去上清液后,将细胞沉淀轻轻重悬于 2 至 3 mL 完全 neurobasal 培养基中。将 100 微升细胞悬液接种到每个孔中,以获得每孔 75, 000 个神经元,混合胶质细胞培养 8 至 10 天。
使用 10 毫升移液器,用神经胶质细胞培养基轻轻洗涤 T75 培养瓶,以收集小胶质细胞,并将细胞和培养基转移到无菌的 50 毫升锥形管中。在 4 摄氏度下以 300 G 离心细胞收集物 5 分钟。去除上清液后,将沉淀轻轻重悬于 2 mL 完全 neurobasal 培养基中。
从 96 孔神经元培养板中,去除 100 微升 neurobasal 培养基,并在每毫升细胞悬液中加入 100 微升 250, 000 个细胞。在共培养中,在神经元和神经突的顶部或之间观察到圆形和大小胶质细胞。