JP 感谢加拿大自然科学与工程研究委员会和萨斯喀彻温大学医学院的资金支持。YD 感谢萨斯喀彻温大学医学院启动基金、加拿大自然科学与工程研究委员会发现补助金 （RGPIN-2023-03659）、MS Canada 催化剂补助金 （1019973）、萨斯喀彻温省健康研究基金会建立补助金 （6368） 和 Brain Canada Foundation 加拿大脑研究未来领袖补助金的资金支持。 图 1A、 图 2A 和 图 3A 是使用 BioRender.com 创建的。

本研究中使用的所有动物均经萨斯喀彻温大学动物护理委员会 （UACC） 和加拿大动物护理委员会 （CCAC） 批准进行饲养和处理。本研究使用怀孕 CD1 小鼠出生后 0-2 天 CD1 雄性和雌性小鼠以及胚胎第 16-18 天 （E16-18） 胚胎。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。
1. 原代小胶质细胞培养
注意：对混合神经胶质细胞和神经元培养物进行计时至关重要，以便小胶质细胞在将神经元接种到 96 孔板后 2 天内成熟并准备好收获。
<ol><li>制备<ol><li>预热完全神经胶质细胞培养基，包括高葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），其中补充有 10% 热灭活胎牛血清、50 U/mL 青霉素/链霉素和 2.92 mg/mL L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1x 非必需氨基酸和 20 mM HEPES，在 37 °C 水浴中。</li>
		<li>向每个 T-75 培养瓶中加入 5 mL 10 μg/mL 聚-L-鸟氨酸 （PO） 氢溴酸盐。轻轻旋转培养瓶，确保 PO 完全覆盖培养瓶底部。在 37 °C 下在 5% CO2 培养箱中孵育至少 1 小时。 注：此包被步骤是促进细胞粘附到 T-75 培养瓶上所必需的。</li>
	</ol></li>
	<li>从 P0-P2 新生小鼠中分离大脑 注意：对所有解剖工具进行消毒并保持试剂的无菌性。确保全程遵守无菌技术。<ol><li>在开始解剖之前，在将要进行解剖的地方用 70% 乙醇或消毒喷雾喷洒台面。设置解剖显微镜并将培养皿置于显微镜下。将 20 mL 的 Leibovitz 的 L-15 培养基倒入培养皿中。不使用显微镜时，请保持培养皿的盖子打开，以减少污染。</li>
		<li>放下几层纸巾，用 70% 乙醇彻底喷洒纸巾。准备解剖工具（解剖剪刀、一对微型镊子和组织镊子），用 70% 乙醇彻底喷洒，然后将工具放在纸巾上。</li>
		<li>将出生后 0-2 天的小鼠转移到纸巾上，并用 70% 乙醇彻底喷洒小鼠。使用解剖剪刀将小鼠斩首（遵循机构批准的方案）。</li>
		<li>轻轻握住头部，在颅骨上做一个从颈部到鼻子的中线切口。用组织镊子将头骨向后剥开，露出大脑。</li>
		<li>使用组织镊子，将镊子插入大脑下方，轻轻地将大脑舀出，然后将大脑从头部提起。立即将大脑放入含有 20 mL Leibovitz's L-15 培养基的培养皿中。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用一对微型镊子小心地去除脑干和脑膜。将大脑收集在含有 5 mL Leibovitz's L-15 培养基的 50 mL 锥形管中。</li>
	</ol></li>
	<li>脑解离、接种和维持混合胶质细胞培养 注：在生物安全柜中执行所有后续步骤。<ol><li>用无菌的一次性手术刀刀片将大脑切成约 1 毫米2 的小块。小心地将切碎的大脑转移到新的 50 mL 无菌试管中。</li>
		<li>向切碎的大脑中加入终浓度为 0.25% 胰蛋白酶的胰蛋白酶，并将组织在 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。每 2-3 分钟，轻轻倒置试管以混合溶液，以帮助组织解离。</li>
		<li>从 5% CO2 培养箱中，将含有 5 mL PO 的 T-75 培养瓶转移到生物安全柜中。丢弃 PO 并用无菌 1x 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 冲洗培养瓶 3 次。确保彻底冲洗培养瓶，因为过量的 PO 对细胞有毒。</li>
		<li>将消化的组织从 37 °C 水浴转移到生物安全柜中。加入 5 mL 完全神经胶质培养基以中和胰蛋白酶。使用 10 mL 移液器轻轻混合组织悬液。</li>
		<li>将无菌 70 μm 尼龙网孔池过滤器放在无菌 50 mL 锥形管上，倒入大约 5 mL L-15 润湿网孔。小心地将细胞悬液倒入细胞过滤器中。从无菌 1 mL 注射器中取出柱塞，使用柱塞将组织研磨成网片以去除组织团块，并产生匀浆细胞悬液。</li>
		<li>定期将大约 5 mL 的 Leibovitz L-15 培养基倒入 70 μm 尼龙网中，然后用 1 mL 注射器柱塞继续研磨网上的组织。当网状物上几乎没有可见组织时，丢弃网状物并将细胞悬液放在一边。</li>
		<li>通过轻轻上下移液来混合细胞悬液。向每个培养瓶中加入等体积的含有 1-2 个脑的细胞悬液和神经胶质细胞培养基，最终体积为 15 mL。</li>
		<li>将细胞在 37 °C 下在 5% CO2 培养箱中孵育过夜。第二天，用无菌 1x PBS 洗涤培养瓶两次，以去除未附着的细胞和碎片。</li>
		<li>向培养物中加入 15 mL 新鲜完全神经胶质细胞培养基，并在 37 °C 下在 5% CO2 培养箱中孵育。3 天后，用 10 mL 新鲜神经胶质细胞培养基更换一半的培养基，其中补充有 40 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF）。 注意：此后，每 3 天用 10 mL 新鲜神经胶质细胞培养基替换一半的培养基，并补充 40 ng/mL 的 MCSF。在收获小胶质细胞之前，培养物维持 8-10 天。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 原代神经元培养
<ol><li>制备<ol><li>解冻来自 B-27 plus 神经元培养系统的 B-27 plus 补充剂。来自 B-27 的 neurobasal plus 培养基加神经元培养系统、1x Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 和热灭活胎牛血清 （FBS），在 37 °C 下在水浴中。</li>
		<li>用 5 mL 10 μg/mL PO 包被 T-25 培养瓶，并在 37 °C 下孵育至少 1 小时。 准备用于解剖的器械和用品。 注：该包被步骤有助于细胞粘附到 T-25 培养瓶上。</li>
	</ol></li>
	<li>从 E16-E18 小鼠胚胎中分离大脑 注意：对所有解剖工具进行消毒并保持试剂的无菌性。确保全程遵守无菌技术。<ol><li>在开始解剖之前，在将要进行解剖的地方用 70% 乙醇或消毒喷雾喷洒台面。设置解剖显微镜并将培养皿置于显微镜下。将 20 mL 的 1x HBSS 倒入培养皿中。不使用显微镜时，请保持培养皿的盖子打开，以减少污染。</li>
		<li>放下几层纸巾，用 70% 乙醇彻底喷洒纸巾。准备解剖工具（弹簧剪刀、一对微型镊子和组织镊子），用 70% 乙醇彻底喷洒，然后将工具放在纸巾上。</li>
		<li>在妊娠第 16-18 天之间使用异氟醚麻醉怀孕的小鼠，并通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。</li>
		<li>将鼠标仰卧在一块浸泡了 70% 乙醇的纸巾上。用 70% 乙醇消毒腹部区域。用组织镊子提起下腹部的皮肤，并用解剖剪刀从该点到下肋骨做一个 V 形切口。</li>
		<li>用组织镊子抓住含有胚胎的子宫角，轻轻地从腹腔中取出胚胎。用 70% 乙醇对含有胚胎的子宫角进行短暂消毒。</li>
		<li>一次从其单个囊中解剖一个胚胎。使用弹簧剪刀，在颅骨顶部创建一个中线切口，从脖子后部开始到鼻子。然后，将头骨从切口部位提起，露出大脑。用组织镊子轻轻舀出大脑，然后将大脑转移到含有 15 mL 1x HBSS 的 10 厘米培养皿中。</li>
		<li>在解剖显微镜下，用一对微型镊子小心地去除脑干和脑皮层两侧的脑膜。将脑皮层转移到含有 10 mL 1x HBSS 的 50 mL 锥形管中，并置于冰上。</li>
	</ol></li>
	<li>细胞培养中大脑解离和皮层神经元接种 注：在生物安全柜中执行所有后续步骤。<ol><li>用无菌一次性手术刀刀片在 50 mL 锥形管中将大脑切成约 1 毫米2 块。将切碎的大脑转移到新的无菌 50 mL 锥形管中。</li>
		<li>将胰蛋白酶加入试管中，终浓度为 0.25%。将试管浸入 35-38 °C 热水浴中 15 分钟，然后每 2-3 分钟轻轻混合试管以匀浆组织。</li>
		<li>将管子从热水浴中取出。轻轻上下移液组织悬液以进一步解离细胞，然后向匀浆悬浮液中加入 0.5 mL 热灭活的 FBS 以中和胰蛋白酶活性。避免气泡，以尽量减少对神经元细胞的毒性。</li>
		<li>将无菌 70 μm 尼龙网状细胞过滤器放在无菌 50 mL 锥形管上，并加入大约 5 mL 的 neurobasal 培养基润湿网状细胞。通过 70 μm 尼龙网状细胞过滤器过滤细胞悬液。使用 1 mL 注射器柱塞，将组织轻轻研磨到细胞过滤器中。定期倒入大约 5 mL 的 1x HBSS，同时继续研磨以清洗细胞过滤器。</li>
		<li>将锥形管在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 在此期间，将 Neurobasal plus 培养基中的 B-27 plus 补充剂稀释至最终浓度的 1 倍，以用作完整的 neurobasal 培养基。</li>
		<li>丢弃 T-25 烧瓶中的 PO，并用 5 mL 的 1x PBS 冲洗烧瓶 3 次。</li>
		<li>小心倒出以去除上清液，并通过轻轻上下吹打 2-3 mL 完全神经基底培养基来重悬细胞沉淀。用血细胞计数器和台盼蓝测定细胞浓度和总细胞数。预计每个胚胎最多有 1.0 x 107 个细胞。</li>
		<li>将细胞接种在 PO 包被的 T-25 培养瓶中，每个培养瓶约 2.0 x 107 个细胞，溶于 5 ml 完全神经基底培养基中。将细胞培养物在 37 °C 下在 5% CO2 培养箱中孵育。</li>
		<li>每 2-3 天更换一次半培养基，用新鲜制备的完全神经基底培养基替换培养瓶中的 2.5 mL 培养基。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 原代神经元和小胶质细胞的共培养
注：所有后续步骤均应在无菌生物安全柜中完成。
<ol><li>在 96 孔板中接种神经元<ol><li>每孔加入 100 μL 10 μg/mL PO，并在 37 °C 下孵育烧瓶至少 1 小时，以用 PO 包被孔。在接种细胞之前，用 1x PBS 洗涤板 3 次，并在最后一次洗涤后吸出任何剩余的液体。</li>
		<li>在 T-25 培养瓶中生长的神经元在培养 2-5 天后收获用于共培养。用 5 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 1 mg/mL DNase I 的 1x Versene 溶液更换培养基，以从培养瓶中分离神经元。将培养瓶放入培养箱中 5-6 分钟进行消化，每 2-3 分钟轻轻旋转一次培养瓶，以帮助细胞分离。</li>
		<li>从培养箱中取出培养瓶，在显微镜下检查细胞是否脱落。加入 0.5 mL 热灭活的 FBS 以中和胰蛋白酶和 DNase I。将细胞转移到 15 mL 锥形管中。用 5 mL 完全 neurobasal 培养基洗涤培养瓶一次，以最大限度地收集神经元。将所有细胞收集在同一个 15 mL 锥形管中。</li>
		<li>将细胞悬液在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于 2-3 mL 完全神经基底培养基中。</li>
		<li>用血细胞计数器计数细胞，并加入完整的神经基础培养基，以达到 7.5 x 105 个神经元/mL 的最终浓度。将 100 μL 细胞悬液接种到 PO 包被的 96 孔板中的每个孔中，以获得 7.5 x 104 个神经元/孔。预计每个培养瓶的产量为 5-600 万个神经元。</li>
		<li>将神经元在 96 孔板中孵育过夜。第二天向每个孔中加入 100 μL 完全 neurobasal 培养基。 注意：一旦神经元表现出适当的神经突突生长（在 96 孔板中接种后第 3-4 天左右），它们就可以与小胶质细胞共培养。</li>
	</ol></li>
	<li>分离和小胶质细胞-神经元共培养<ol><li>在混合胶质细胞培养 8-10 天之间，用 10 mL 移液管轻轻洗涤每个培养瓶中装有神经胶质细胞培养基的 T-75 培养瓶，收集小胶质细胞，然后将细胞和培养基转移到无菌的 50 mL 锥形管中。用 10 mL 新鲜神经胶质细胞培养基再次洗涤培养瓶，以从培养瓶中分离额外的小胶质细胞并收集培养基。预计每个培养瓶的产量为 7.5 x 105 个小胶质细胞。</li>
		<li>向每个培养瓶中加入 20 mL 补充有 20 ng/mL MCSF 的新鲜神经胶质细胞培养基。如果维持混合胶质细胞培养物，小胶质细胞可以再收获一次或两次。</li>
		<li>将细胞收集物在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 小心去除上清液，并将沉淀轻轻重悬于 2 mL 完全 neurobasal 培养基中。</li>
		<li>用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。添加完全的 neurobasal 培养基，终浓度为 2.5 x 105 个细胞/mL。</li>
		<li>从 96 孔神经元培养板中，去除 100 μL 神经基底培养基，并加入 100 μL 2.5 x 105 个细胞/mL 细胞悬液，以每孔 7.5 x 104 个神经元接种 2.5 x 104 个小胶质细胞。将培养物在 37 °C 下在 5% CO2 培养箱中孵育过夜，以使小胶质细胞沉淀。共培养物现在可用于下游实验。</li>
	</ol></li>
</ol>

 用于 CNS 相互作用研究的原代小胶质细胞和神经元共培养方案

作者声明没有利益冲突。

本文介绍了一种分离和培养小鼠原代神经元和原代小胶质细胞的方案，随后用于建立小胶质细胞-神经元共培养物，可用于研究小胶质细胞和神经元相互作用如何调节其细胞健康和功能。这种相对简单易行的方法可以为 CNS 中小胶质细胞神经元相互作用的机制和功能结果提供关键见解。
为了实现最佳的共培养，该方案中的几个关键方面需要格外小心。在脑分离期间（步骤 1.2.6 ?...

小胶质细胞是组织驻留的巨噬细胞，可促进中枢神经系统 （CNS） 的免疫监视和稳态1,2,3。它们起源于卵黄囊红髓样祖细胞，在胚胎发育过程中定植于大脑 4,5,6，并通过自我更新（涉及增殖和细胞凋亡）在生物体的整个生命周期中维持7。在稳态时，静息小胶质细胞分化形态并参与组织监测 8,9,10。
小胶质细胞表达许多细胞表面受体，这使它们能够快速响应 CNS 的变化11,12，并在感染或组织损伤的情况下促进炎症反应 12,13,14，以及在神经退行性疾病期间 9,15，如多发性硬化症 （MS）16,17.小胶质细胞还表达各种神经递质和神经肽的受体 18,19,20，这表明它们也可能响应并调节神经元活动 21,22。事实上，小胶质细胞和神经元以各种形式的双向通讯相互作用 8,23，例如由膜蛋白介导的直接相互作用或通过可溶性因子或中间细胞的间接相互作用23,24。
例如，神经元分泌的各种神经递质可以调节小胶质细胞的神经保护或炎症活性 25,26,27。此外，神经元和小胶质细胞之间的直接相互作用有助于将小胶质细胞维持在稳态28。相反，小胶质细胞与神经元的直接相互作用可以塑造神经元回路29 并影响神经元信号转导 30,31,32。由于这些相互作用的破坏会诱导神经元的过度兴奋30 和小胶质细胞反应性33,34，失调的小胶质细胞-神经元相互作用被认为是神经系统疾病的一个促成因素33,35。事实上，精神病23,26 和神经退行性疾病已被描述为表现出功能失调的小胶质细胞-神经元相互作用33。虽然这些观察结果强调了小胶质细胞-神经元通讯在 CNS 中的重要性，但这些相互作用如何调节健康和疾病中小胶质细胞和神经元功能的具体机制相对未知。
在 CNS 等复杂环境中，多种环境因素会影响小胶质细胞-神经元相互作用，从而限制了研究 体内瞬时细胞相互作用的能力。在这里，我们提出了一种 体外 小胶质细胞-神经元共培养系统，可用于研究小胶质细胞和神经元之间的直接细胞相互作用。该方案分别描述了出生后第 0-2 天和胚胎小鼠第 16-18 天之间从新生小鼠皮层产生原代小胶质细胞和神经元。然后将神经元和小胶质细胞在 96 孔板中共培养，用于下游高通量实验。我们之前使用这种方法来证明小胶质细胞吞噬作用保护神经元免受氧化磷脂酰胆碱介导的细胞死亡37，这表明这种方法可以帮助理解小胶质细胞在神经变性和 MS 中的作用。同样，小胶质细胞-神经元共培养也可能有助于研究小胶质细胞-神经元串扰在其他情况下的影响，例如病毒感染38 或神经元损伤和修复39。总体而言， 体外小 胶质细胞-神经元共培养系统使研究人员能够在可操作和受控的环境中研究小胶质细胞-神经元相互作用，这与 体内 模型相辅相成。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A3653401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 Medium (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony stimulating factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>103780-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S11008-42</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-126-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flasks&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Codman</td>
			<td>30-4218</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12052-10</td>
			<td>Autoclaved/Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Thermofisher Sci&#160;</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Sci</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Immunofluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and co-culturing murine primary microglia and cortical neurons

小胶质细胞是中枢神经系统 （CNS） 的组织驻留巨噬细胞，执行支持神经元健康和 CNS 稳态的许多功能。它们是与 CNS 疾病活动相关的免疫细胞的主要群体，采用反应性表型，在慢性神经退行性疾病（如多发性硬化症 （MS））期间可能导致神经元损伤。由于解决小胶质细胞、神经元和其他 CNS 环境因素之间复杂的 体内 相互作用的挑战，小胶质细胞在健康和疾病期间调节神经元功能和存活的不同机制仍然有限。因此，共培养小胶质细胞和神经元的 体外 方法仍然是研究小胶质细胞-神经元相互作用的宝贵工具。在这里，我们提出了一种从小鼠生成和共培养原代小胶质细胞和神经元的方案。具体来说，在出生后 0-2 天之间，从来自新生小鼠脑匀浆的混合胶质细胞培养物 中 分离出小胶质细胞。在胚胎第 16-18 天之间从小鼠胚胎的脑皮层中分离出神经元细胞。 体外 4-5 天后，将神经元细胞接种在 96 孔板中，然后加入小胶质细胞以形成共培养物。仔细的时间安排对于该方案至关重要，因为两种细胞类型都需要达到实验成熟度才能建立共培养。总体而言，这种共培养可用于研究小胶质细胞-神经元相互作用，并且可以提供多种读数，包括免疫荧光显微镜检查、实时成像以及 RNA 和蛋白质检测。

Microglia are tissue-resident macrophages that facilitate immunosurveillance and homeostasis in the central nervous system (CNS)1,2,3. They originate from yolk sac erythromyeloid progenitor cells that colonize the brain during embryonic development4,5,6&#160;and are maintained throughout the organism&#39;s life span through self-renewal, which involves proliferation and apoptosis7. At steady-state, resting microglia have ramified morphology and engage in tissue surveillance8,9,10.
Microglia express numerous cell-surface receptors, which enables them to rapidly respond to changes in the CNS11,12 and to promote inflammatory responses in the event of infections or tissue injury12,13,14, as well as during neurodegenerative diseases9,15, such as&#160;multiple sclerosis (MS)16,17. Microglia also express receptors to various neurotransmitters and neuropeptides18,19,20, which suggests they may also respond to and regulate neuronal activity21,22. Indeed, microglia and neurons interact in various forms of bidirectional communication8,23 such as direct interactions mediated by membrane proteins or indirect interactions through soluble factors or intermediate cells23,24.
For instance, various neurotransmitters secreted by neurons can modulate the neuroprotective or inflammatory activity of microglia25,26,27. Additionally, direct interactions between neurons and microglia help to maintain microglia in a homeostatic state28. Conversely, direct interactions of microglia with neurons can shape neuronal circuitry29 and influence neuronal signaling30,31,32. As disruptions of these interactions induce hyperexcitability of neurons30 and&#160;microglia reactivity33,34, dysregulated microglia-neuronal interactions&#160;are implicated&#160;as a contributing factor to&#160;neurological diseases33,35. Indeed, psychotic23,26 and neurodegenerative diseases have been described to exhibit dysfunctional microglia-neuronal interactions33. While these observations highlight the importance of microglia-neuronal communication in the CNS, specific mechanisms of how these interactions regulate microglial and neuronal functions in health and disease are relatively unknown.
Within a complex milieu such as the CNS, multiple environmental factors can influence microglia-neuronal interactions, which limits the ability to study transient cellular interactions in vivo. Here, we present an in vitro microglia-neuronal co-culture system that can be used to study direct cellular interactions between microglia and neurons. This protocol describes the generation of primary microglia and neurons from the cortices of neonatal mice between post-natal days 0-2 and embryonic mice days 16-18, respectively. Neurons and microglia are then co-cultured in 96-well plates for downstream high-throughput experiments. We previously used this approach to demonstrate that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine mediated cell death37, suggesting that this method can help to understand the roles of microglia in the context of neurodegeneration and MS. Similarly, microglia-neuronal co-cultures may also be useful for investigating the impact of microglia-neuronal crosstalk in other contexts such as viral infections38 or neuronal injury and repair39. Overall, in vitro microglia-neuronal co-culture systems&#160;enable researchers to study microglia-neuronal interactions in a manipulatable and controlled environment, which complements in vivo models.

作者聚焦：用于研究疾病条件下小胶质细胞-神经元相互作用的体外共培养模型

生成和共培养小鼠原代小胶质细胞和皮质神经元

Our research aims to investigate the interactions between neurons and microglia during disease conditions such as multiple sclerosis. We aim to recapitulate microglia neuronal interactions in vitro to better understand their functional importance in the CNS. We previously demonstrated that microglia phagocytosis protects neurons from oxidized phosphatidylcholine-mediated cell death with this co-culture.While other co-culture systems are also employed, this mixed culture system enables direct and close contact between microglia and neurons. In addition, it can remain healthy from 12 days to potentially three weeks, allowing for long-term studies of neuronal microglia interactions. Our protocol offers a simple and accessible method to co-culture microglia neurons that are easily manipulatable and can be further used in downstream assays to determine cellular functional changes.

图 1A 显示了小胶质细胞混合胶质细胞培养关键步骤的流程图。总体而言，预计第 1 天会出现稀疏的细胞和过多的细胞碎片（图 1B）。到第 4 天，应观察到细胞数量增加，尤其是贴壁星形胶质细胞的产生，如其细长的形态所示（图 1C）。可以在星形胶质细胞顶部观察到一些小胶质细胞，或者作为漂浮在培养基中的小圆形细胞。到第...

该方案描述了从胚胎第 15-16 天从小鼠胚胎中分离的原代神经元细胞和出生后第 1-2 天从新生小鼠大脑产生的原代小胶质细胞建立的小胶质细胞-神经元共培养物。

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

736 次观看.  University of Saskatchewan. 我们的研究旨在研究多发性硬化症等疾病条件下神经元和小胶质细胞之间的相互作用。我们的目标是在体外概括小胶质细胞神经元的相互作用，以更好地了解它们在 CNS 中的功能重要性。我们之前证明，小胶质细胞吞噬作用通过这种共培养保护神经元免受氧化磷脂酰胆碱介导的细胞死亡。虽然还采用了其他共培养系统，但这种混合培养系统能够?...

视频: 作者聚焦：用于研究疾病条件下小胶质细胞-神经元相互作用的体外共培养模型

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

科研

神经科学

Brain Isolation from Neonatal Mice for Primary Microglia Culture

To begin, add 5 milliliters of 10 micrograms per milliliter Poly-L-ornithine hydrobromide to each T75 flask. Incubate at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator for at least one hour. After decapitating the mouse, gently hold the head and create a midline incision in the cranium, starting from the neck to the nose.Peel the skull back with tissue forceps to reveal the brain. To scoop the brain out, insert the tissue forceps under the brain, and lift the brain out from the head. After placing the brain into a Petri dish containing 20 milliliters of Leibovitz's L-15 media under a dissection microscope, using a pair of micro-forceps, carefully remove the brainstem and the meninges.Collect the brains in a 50-milliliter conical tube containing 5 milliliters of Leibovitz's L15 media.

从新生小鼠中分离大脑用于原代小胶质细胞培养

Preparing and Maintaining Mixed Glia Culture Derived from Neonatal Mice Brains

To begin, mince the isolated brains into approximately one-square-millimeter pieces with a sterile disposable scalpel blade. Carefully transfer the minced brains into a new sterile 50 milliliter tube. Add a final concentration of 0.25%trypsin to the minced brains.Incubate the tissue in a 37-degrees-Celsius water bath for 20 minutes. Add five milliliters of complete glia culture media to neutralize the trypsin and gently mix the tissue suspension using a 10 milliliter pipette. Carefully decant the cell suspension through the cell strainer.Then remove the plunger from a sterile one-milliliter syringe and grind the tissue into the mesh using the plunger. Add equal volumes of cell suspension containing one to two brains with glia culture media to each flask resulting in a final volume of 15 milliliters. Sparse cells and excessive cellular debris were observed on day one.By day four, adherent astrocytes were generated. Confluent cells with typical astrocyte morphology were observed by day eight of culture.

制备和维持来自新生小鼠大脑的混合胶质细胞培养物

Isolating Brains from E16-E18 Mouse Embryos for Primary Neuron Culture

Begin by coating T25 flasks with five milliliters of 10 micrograms per milliliter poly-L-ornithine, and incubate them. To isolate the brain from mouse embryos, lift the skin of the euthanized pregnant mouse's lower abdomen with tissue forceps. Using dissection scissors, perform a V-shaped incision from this point to the lower rib cage.Grab the uterine horns containing the embryos with tissue forceps, and gently remove the embryos from the abdominal cavity. Using spring scissors, create a midline incision at the top of the skull, starting from the back of the neck to the nose. Lift the skull away from the incision site to reveal the brain.Gently scoop out the brain with tissue forceps and transfer the brain to a 10 centimeter Petri dish containing 15 milliliters of Hanks'balanced salt solution. Under a dissection microscope, carefully remove the brainstem and the meninges on both sides of the brain cortices with a pair of micro forceps.

从 E16-E18 小鼠胚胎中分离大脑用于原代神经元培养

Brain Dissociation and Seeding of Cortical Neurons in Cell Culture 

To begin, mince the isolated brains into pieces in the 50-milliliter conical tube with a sterile disposable scalpel blade. Add trypsin to the tube at a final concentration of 0.25%Immerse the tube in a 35 to 38 degrees Celsius hot water bath for 15 minutes. Gently pipette the tissue suspension up and down to dissociate cells.Then add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to the homogenized suspension to neutralize trypsin activity. Filter the cell suspension through the 70-micrometer nylon mesh cell strainer. Using a one-milliliter syringe plunger, gently grind the tissue into the cell strainer.Then centrifuge the conical tube at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. Discard the Poly-L-Ornithine in the T25 flasks and rinse the flasks three times with five milliliters of PBS. Carefully decant the tube to remove the supernatant and resuspend the cell pellet by gently pipetting with two to three milliliters of complete neurobasal media.Plate the cells in the Poly-L-Ornithine-coated T25 flasks with approximately 20 million cells per flask in five milliliters of complete neurobasal media. Incubate the cell culture at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide incubator. Neurons in T25 flasks and 96-well plates adhered and formed neurite processes by day three.Suboptimal neuron cultures contained cell clumps and debris.

细胞培养中皮层神经元的脑解离和接种 

Co-Culture of Primary Neurons and Microglia for Studying Microglia-Neuron Interactions

To begin, take neurons grown in T25 flasks for co-culture. Replace the media with five milliliters of versene solution containing trypsin and Dnase I.Add 0.5 milliliters of fetal bovine serum to neutralize the trypsin and Dnase I.Transfer cells to a 15 milliliter conical tube. Wash the flask with five milliliters of complete neurobasal media once to maximize the collected neurons.Then, centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees celsius. After discarding the supernatant, gently resuspend the cell pellet in two to three milliliters of complete neurobasal media. Seed 100 microliters of the cell suspension to each well to obtain 75, 000 neurons per well, between eight to 10 days of mixed glia cultivation.Using a 10 milliliter pipette, gently wash the T75 flasks with glia culture media to collect microglia and transfer the cells and media into a sterile 50 milliliter conical tube. Centrifuge the cell collection at 300 G for five minutes at four degrees celsius. Once the supernatant is removed, gently resuspend the pellet in two milliliters of complete neurobasal media.From the 96-well neuronal culture plate, remove 100 microliters of neurobasal media and add 100 microliters of 250, 000 cells per milliliter cell suspension. In co-culture round and large microglia were observed on top or between neurons and neurite processes.

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作者聚焦：用于研究疾病条件下小胶质细胞-神经元相互作用的体外共培养模型