基于原子力显微镜的压痕测量用于蝾螈肢体切片的组织刚度分析

在原子力显微镜或 AFM 测量之前，将悬臂安装在玻璃块上。将装满 PBS 的培养皿插入电机载物台的支架中，然后将玻璃块插入 AFM 头。然后将 AFM 头放在培养皿上，使悬臂浸入缓冲液中并手动对准激光。

在 JPK 软件中，按下 approach and acquire 按钮将悬臂推进到坚硬的表面上。获取单个力-距离曲线后，打开校准管理器，然后在方法下选择基于接触。然后将室温调节到 20 摄氏度。

现在放大曲线并选择灵敏度拟合的线性部分。单击灵敏度复选框，将悬臂从表面缩回 200 微米。然后选中无穷大符号复选框并单击 Run Thermal Noise。

接下来，放大生成的频率图并使用鼠标右键单击按钮定义范围。选中 Spring Constant 复选框并关闭校准管理器。将含有嵌入组织块和培养基中的再生蝾螈肢的培养皿插入 AFM 的培养皿支架中。

在明场模式下获取组织块的概览图像。放大感兴趣的区域并调整曝光时间和焦距。设置压痕测量的网格参数，并记录力-距离曲线数组。

要在 PyJibe 软件中进行数据处理，请打开包含力位移曲线的文件。选择 preprocess 选项卡，然后在 contact point estimation 下，选择 piece fit with line 和 polynomial。然后选择拟合选项卡，在模型下选择球形压头，在方法下选择 nelder。

对于 PyJibe 软件中的粘弹性分析，请打开包含力距离曲线的文件。选择 preprocess 选项卡，然后在 contact point estimation 下，选择 piece fit with line 和 polynomial。然后选择拟合选项卡，在模型下，选择使用 KVM 模型校正粘弹性的赫兹模型。

在 method （方法） 下，选择 leastsq。将精确压头半径设置为 10 微米，接近速度设置为每秒 7.5 微米。按应用模型和全部拟合可获得表观和不松弛杨氏模量、表观粘度和 Maxwell 单元弛豫时间。

完整肢体桡骨和尺骨的 Apparent Young 模量测量显示没有显着差异。在组织溶解阶段，桡骨和尺骨的表观杨氏模量分别急剧下降至 0.03 和 0.13 千帕。完整软骨中心的表观 Young 模量高于外围。

在组织溶解阶段，表观 Young 模量测量显示软骨中心和外围之间没有显着差异。在软骨凝结过程中，表观杨氏模量显着增加到 0.77 千帕，代表中等刚度值。在组织溶解和压缩软骨过程中，未松弛的模量在完整组织中显示出显着差异。

表观杨氏模量与未松弛模量高度相似，表明主要为弹性响应。与完整组织和浓缩软骨相比，组织溶解过程中的表观粘度显着降低。