巨噬细胞感染测定中靶向 脓肿分枝杆菌 的化合物的抗菌活性和毒性评估

为了从野生型成年小鼠的骨髓中获得巨噬细胞，将骨髓细胞接种在含有补充有 10% FBS 和 10%LCCM 的 DMEM 的 96 孔光学处理平底板中。将细胞在 37 摄氏度和 7% 二氧化碳下孵育 10 天。分化后，将 75 微升脓肿分枝杆菌悬浮液移液移液到含有孔的巨噬细胞中。

将细胞在 37 摄氏度和 7% 二氧化碳下孵育 4 小时。使用配备有小盒的微孔板试剂分配器，将 110 微升补充有 10% FBS 和 10%LCCM 的 DMEM 添加到化合物或溶剂对照柱中。将另外 104 微升补充有 10% FBS 和 10% LCCM 的 DMEM 分配到含有最高浓度化合物或溶剂的色谱柱中。

现在将 5.9 μL 化合物或溶剂移液到色谱柱的指定孔中。使用多通道微量移液器，对每种化合物和溶剂进行两次连续稀释。最后一次稀释后，丢弃最后一个孔中多余的 110 μL 培养基。

将 110 微升补充有 10% FBS 和 10%LCCM 的 DMEM 添加到所有色谱柱中，不包括空白孔。在 DMEM 中制备浓度为 2 μg/mL 的克拉霉素溶液。孵育后，从培养箱中取出含有感染巨噬细胞的 96 孔板。

使用洗板机，用 200 微升感染洗涤液洗涤细胞 3 次。将 200 微升化合物转移到含有受感染巨噬细胞的板中。然后将 200 微升补充的细胞培养基和克拉霉素溶液添加到各自的孔中。

将板在 37 摄氏度下与 7% 二氧化碳一起孵育 48 小时。孵育后，用 200 μL 化合物洗涤液洗涤感染细胞 3 次。使用多通道微量移液器，将 200 μL 固定液分配到所有孔中，并孵育 10 分钟。

洗涤细胞后，将 200 μL 渗透性溶液转移到所有孔中，并孵育 15 分钟。接下来，吸出渗透性溶液，然后将 100 微升染色溶液加入所有孔中。在室温下孵育 30 分钟。

孵育后，用 200 μL 化合物的洗涤液洗涤细胞 3 次。要使用高内涵成像系统筛选板，请选择 96 微量滴定板的板类型。物镜为 20 倍，数值孔径为 0.4，模式为共聚焦。

然后，选择 DAPI、CellMask deep red 和 mCherry 通道，分别捕获染色的细胞核、细胞质和细菌信号。选择板的孔和每个孔的相应字段进行分析。接下来，单击测试并捕获图像以检查设置。

最后，设置一个设备处理机器人，在夜间自动采集图像。该机械臂无需人工干预即可更换高内涵成像系统中的板。化合物柔红霉素、多柔比星、硫链球、表柔比星和双羟萘酸吡啶对分枝杆菌感染的巨噬细胞具有毒性，导致细胞活力低于 85%。

化合物莫沙内酰胺和贝西沙星在 13.3 微摩尔时分枝杆菌活力低于 50%，但与 DMSO 对照无显著差异。化合物头孢地尼、加替沙星和莫西沙星对 13.3 微摩尔的细胞内分枝杆菌有效，其中化合物双羟萘酸吡咯铵最活跃。化合物、罗红霉素、克拉霉素和利福布汀对细胞内分枝杆菌显示出极强的效力，克拉霉素在所有浓度下将分枝杆菌活力降低至 10% 以下。