<p>我们感谢杰恩Selegue，玛格丽特霍林斯沃思，金莓果，亮Futahashi，Najmus萨哈尔牢哈，亚历山大Popadic，鲍勃里德，罗氏帮助排除本议定书的技术支持。我们也感谢威廉彼尔编辑电影的意见。 </p>

<p class="jove_title">第1天</p><ol><li>准备了以下解决方案： <ul><li> 10X PBS </li><li> 1X PBS </li><li> 1X PBT </li><li> DDH <sub>2</sub> Ø <ul><li>添加0.1％，总体积的DEPC处理和动摇的解决方案大力。 </li><li>高压灭菌。 </li></ul></li><li> 4％多聚甲醛固定 - 用PBS用DEPC </li><li>蛋白酶K的解决方案 - 如果沉淀物存在，涡大力前删除等分</li><li>消化终止缓冲液</li><li>预杂交缓冲</li><li> 50:50 PBT：预杂交缓冲</li><li>杂交缓冲液<ul><li>解决方案应保持无RNase。使用已经出炉无论是玻璃制品（250 ° C，4小时）或一次性塑料。血清移液器是非常有用的解决方案</li></ul></li></ul></li><li>解剖从翅膀的时间上演蛹在PBS </li><li>移动的翅膀，直接固定在井24孔培养板在室温下的缓冲区</li><li>修正了2个小时的光碟</li><li>在PBT洗5 × 5分钟</li><li>蛋白酶K溶液中孵育3分钟的翅膀</li><li>停止在消化缓冲液冲洗2 × </li><li>在PBT洗5 × 5分钟</li><li>洗2 × 5分钟，在50:50 PBT：PHB </li><li> 1 × 10分钟洗净的PHB </li><li> PHB至少1小时的孵育55 ° C。 </li><li>热变性RNA探针（20 - 50ng每口井需要）（80 ° C为5分钟），并添加杂交缓冲液（每口井所需的100μL） </li><li>探头井孵育48小时，在55 ° C </li></ol><p class="jove_title">第3天</p><ol><li>洗净4 × 5分钟，55 ° C的PHB </li><li>在PHB的孵育过夜，55 ° C </li></ol><p class="jove_title">第4天</p><ol><li>准备了以下解决方案： <ul><li>抗体块缓冲区</li></ul></li><li> 1个5分钟在50:50 PBT：PHB的洗净</li><li>在PBT洗4 × 5分钟</li><li>孵育1小时块缓冲区的翅膀在4 ° C </li><li>在1:2000稀释的抗地高辛抗体4℃过夜孵育翅膀° C </li></ol><p class="jove_title">第5天</p><ol><li>准备以下解决方案： <ul><li>检测缓冲液</li></ul><ul><li>开发解决方案 - 光敏感（铝箔包装） </li></ul></li><li>在室温下清洗3 × 5分钟，在PBT </li><li>洗净7 × 5分钟在PBT </li><li>冲洗翅膀两次检测缓冲液</li><li>制定在1毫升开发解决方案的翅膀 - 时间的发展，必须监测每次 - 发展的时代，可以改变，即使使用相同的探针和发展的解决方案 - 检查一般5-10分钟后，再增加间隔在一夜之间。板应在铝箔包裹，以防止光线照射时不检查样品。 </li><li>发展终止缓冲液冲洗5次</li><li>摩的翅膀。 </li></ol>

<ol>
	<li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings.">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>265</b>, 109-114 (1994).</li><li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation.">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Research</em>. <b>20</b>, 3791-3792 (1992).</li><li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution.">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> <em style='font-style: italic'>Science</em>. <b>283</b>, 532-534 (1999).</li><li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana.">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> <em style='font-style: italic'>Proc R Soc Lond B (Suppl)</em>. <b>271</b>, S263-S265 (2004).</li><li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology.">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> <em style='font-style: italic'>BMC Developmental Biology</em>. <b>6</b>, 52 (2006).</li><li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter.">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> <em style='font-style: italic'>BMC Developmental Biology</em>. <b>6</b>, 55 (2006).</li><li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns.">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> <b>9</b>, 109-115 (1999).</li></ol>

<p>优化现有的协议</p><p>幼虫翼片原位杂交已成功采用PRECIS coenia蝴蝶光盘（卡罗尔等人1994;。键等，1999;。Weatherbee等1999年）。从卡罗尔实验室的要求后，幼虫翼染色法进行详细的书面协议，目前协议已经适应。我们所做的改变，以适应幼虫和蛹的右翼组织之间的差异。蛹hindwing解剖期间，peripodial膜应被删除，并且不包括在井。初步修复时间更长，在我们的协议，但已被删除后的修复步骤。我们发现，10倍稀释的蛋白...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fix Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4% Paraformaldehyde in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>PBT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1% Tween 20 in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Proteinase K solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2.5&#xF06D;g/ml Proteinase K in PBT</td>
</tr>
<tr>
<td>Digestion Stop Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2 mg/ml glycine in PBT</td>
</tr>
<tr>
<td>Pre-Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Block Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA
</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-DIG</td>
<td>Ab</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 093 274 910</td>
<td>Alkaline Phosphatase conjugated</td>
</tr>
<tr>
<td>DIG Wash and Block Buffer Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11 585 762 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0612</td>
<td>Mounting Medium </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>
		

in situ protocol for butterfly pupal wings using riboprobes

<p class="jove_content">在这里，我们目前，在视频格式，在原位杂交，在蝴蝶Bicyclus anynana的蛹翅膀使用riboprobes协议。原位杂交，发育生物学的重要支柱，是很有用的研究发展组织在转录水平的基因表达的空间和时间的模式。如果目标基因转录的蛋白产物的抗体，有尚未被开发，和/或有多个基因的拷贝无法区别使用可用抗体的基因组中的一个特定的蛋白质，在所在地可以用来代替。虽然幼虫翼光盘原位技术已经几年的蝴蝶，目前的协议进行了优化，为更大，更脆弱的蛹翅膀。</p>

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In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

<p class="jove_content">为了检验在Bicyclus anynana蛹右翼组织的基因表达，我们目前在使用riboprobes原位杂交优化协议。我们还提供指引，为进一步优化本议定书在其他鳞翅目物种蛹翅膀。</p>

在原位议定书“蝴蝶蛹使用Riboprobes翼

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K 次观看.  SUNY-University at Buffalo. 为了检验在Bicyclus anynana蛹右翼组织的基因表达，我们目前在使用riboprobes原位杂交优化协议。我们还提供指引，为进一步优化本议定书在其他鳞翅目物种蛹翅膀。