国防部部W81XWH - 05 - 1 - 0005，W81XWH - 06 - 1 - 0495，W81XWH - 08 - 1 - 0029和W81XWH - 08 - 1 - 0356

1。准备GST融合蛋白<ol><li> JM109感受态细菌，包含第一的N -端90个氨基酸的rhotekin Rho的结合域（RBD）的进入BamH1/EcoR1 pGEX3x载体亚克隆酸甘油。 为了确保高效率，必须执行以下步骤，每个实验。根据我们的经验，新鲜的GST - RBD的是一个强大的和准确的GTP酶激活检测的关键。 </li><li>加入50微升（近似的，没有解冻）甘油50毫升的LB放大器和成长37℃摇动过夜。 </li><li> 1:10稀释500毫升LB放大器，并成长为1小时</li><li> 0.1 mM的IPTG的2小时诱导的GST -蛋白生产。 </li><li>离心瓶，离心，Sorval GSA3转子均匀分布在5000 RPM的4 ° C下20分钟。 </li><li>离心瓶，10 mL裂解缓冲液中的悬浮颗粒*。 *细菌细胞裂解液：20％的蔗糖，10％甘油，50毫米的Tris pH值8.0，0.2毫米的Na 2 S 2 O 5，2毫米，2毫米的DTT MgCl 2的，添加新鲜的PMSF，苯甲酰胺，抑肽酶和亮肽素。 </li><li>超声2-3分钟（这取决于sonicator类型，我们使用一个菲舍尔声波Dismembranator 500型商标6集，50％的周期）。 </li><li>离心机，Sorvall SS34，20分钟10,000转，4 ° C。此时可以采取的一个小等分，并经SDS - PAGE运行。凝胶可以考马斯染色，应在46 kDa的乐队明显。 </li><li>去除上清液，加入1毫升50％glutatione琼脂糖4B浆。 </li><li>孵育30分钟，在4 °旋转彗星。裂解缓冲液洗3次。 </li><li>重悬GST-RBD/glutatione-Sepharose珠50％的浆料（约1毫升），GST鱼缓冲区** ** GST鱼缓冲液：10％甘油，50毫米的Tris pH值7.4，氯化钠100毫米，1％NP - 4，2毫米氯化镁2，添加新鲜的PMSF，苯甲酰胺，抑肽酶和亮肽素</li></ol> 2。 GST融合下拉检测<ol><li>使用5-10 × 10 6细胞/检测</li><li>洗涤细胞一次在冰冷的PBS，保持冰板（我们使用平面的玻璃皿盛满冰块）和裂解0.5毫升GST鱼缓冲区。 </li><li>在冰上孵育5分钟，收获细胞，用橡胶警察或平刮板，转移到离心管和离心机20,000 RPM 5分钟，在4 ° C。 </li><li>上清转移到一个新的离心管。取50μL，以确定总的Rho（即国内生产总值+ GTP的约束）。 </li><li>加入0.5毫升GST-RBD/glutatione-Sepharose珠，并在4 ° C孵育，用旋转过夜。 </li><li>洗与GST鱼缓冲区的6倍。 </li><li>在40μL2X - Laemelli样品缓冲液重悬珠 此时浓度的确定应采取的总的Rho蛋白在2.4等分和30微克准备在凝胶上运行相应的激活范例。 </li><li>煮沸样品在90 ° C为5分钟，离心，取上清液（即避免珠）负载和12个4-20％梯度SDS - PAGE凝胶上运行。 </li><li>运行在不高于150伏凝胶转移到膜的使用Towbin缓冲区和常量100 W </li><li>座与5％的奶粉/ TBST解决方案和探头中RhoC - specfic抗体的膜。 </li></ol> 3。代表性的成果良好的效果，产生约22 kDa的单波段。坏的结果产生多个频段或高背景。这是蛋白质的降解，不完整的样品洗涤或使用旧GST - RBD的指示。 <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="图1" /> 图1显示三个独立的细胞株，表达RhoC的GTP酶的不同层次表现出积极和总RhoC的高层次，积极和总RhoC的或没有RhoC的水平低。然后剥离印迹和看家基因肌动蛋白的抗体，作为一个总RhoC蛋白的装载的控制reprobed。 <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="图2" /> 图2多个频段或高蛋白质的降解，不完整的样本的洗涤或使用旧GST - RBD的背景。

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	<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase,+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype.">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells.">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor.">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li><li>Golen, K. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility,+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer.">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li><li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility.">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li><li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+Collagen+receptor+(alpha2beta1)+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase.">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li><li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology,+invasion+and+tumor+cell+diapadesis.">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li><li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac.">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int J Cancer. , (2010).</li><li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+downregulates+Rho+activity:+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior.">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li></ol>

该过程最关键的一步，是新鲜的GST - RBD的一代。密切关注到了这一步的失败是失败的主要原因。所有步骤，从GST - RBD的一代（1.2）孵育过夜的细胞裂解液（2.5），应在一天内完成。另一个关键的一步就是让某些有足够的细胞产生的细胞裂解液。这是在RhoC的GTP酶，它往往是在细胞水平低时，具有特别重要的意义。

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gluthione-sepharose 4B beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0756-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Criterion 4-20% Tris-HCl gels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>345-0032</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rhoc gtpase activation assay

RhoC的GTP酶有91％的同源性GTP酶RhoA的。由于其在细胞中的患病率，许多试剂和GTP酶RhoA的技术已经开发出来。然而，RhoC的GTP酶表达的转移性癌细胞处于较低水平。因此，数RhoC的特定试剂已经开发出来。我们已经适应了一个Rho的激活检测，检测RhoC的GTP酶。这种技术利用商品及服务税的Rho结合结构域融合蛋白拉出积极RhoC的GTP酶。此外，我们可以在检测开始收获总蛋白，以确定总水平（GTP和GDP结合）RhoC的GTP酶。这使得主动与总RhoC的GTP酶在细胞中的决心。此过程中的几个商业版本，但是已经开发，商业试剂盒优化GTP酶RhoA的，通常不工作中RhoC GTP酶。检测的部分已被修改，以及作为一个RhoC的特异性抗体的发展。

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RhoC GTPase Activation Assay

该协议利用上拉下来检测，以确定细胞内的活动中RhoC GTP酶的水平。

RhoC的GTP酶激活法

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Research

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Biology

12.3K 次观看.  University of Delaware. 该协议利用上拉下来检测，以确定细胞内的活动中RhoC GTP酶的水平。