这项工作是由国家卫生部授予GM086822和国家科学基金会主要研究仪器授予在DBI-0960313研究院。笔者想感谢博士。乔恩宅唐娜·哈迪（Bio-Rad公司）和他们的技术专长，詹妮弗Loertscher（西雅图大学）。选择色谱试剂和补充仪器Bio-Rad公司提供的慷慨。

<ol>
	<li>Cummins, P. M., O'Connor, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interaction+chromatography.">Hydrophobic interaction chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).</li><li>Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+modeling+of+nonlinear+hydrophobic+interaction+chromatographic+systems.">Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).</li><li>To, B. C., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins.+IV.+Protein+adsorption+capacity+and+transport+in+preparative+mode.">Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).</li><li>Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+mild+hydrophobic+interaction+chromatography+for+"method+scouting"+protein+purification+strategies+in+aqueous+two-phase+systems:+a+study+using+model+proteins.">On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins.</a> Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).</li><li>Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+proteins+in+receptor+research:+an+emerging+tool+for+drug+discovery.">Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).</li><li>Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L.A+Protocol+for+the+Production+of+KLRG1+Tetramer.">L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer.</a> J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+Magnetosome+Associated+Protein+MamA&#916;41.">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&#916;41.</a> J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).</li><li>Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automatic+system+for+multidimensional+integrated+protein+chromatography.">An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).</li><li>Camper, D. V., Viola, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+protein+purification.">Fully automated protein purification.</a> Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).</li><li>Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+green+fluorescent+protein+screen+for+identification+of+well-expressed+membrane+proteins+from+a+cohort+of+extremophilic+organisms.">A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms.</a> Protein Sci. 18, 121-133 (2009).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression,+purification,+and+crystallization.">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).</li><li>Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins.">Hydrophobic interaction chromatography of proteins.</a> J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).</li><li>McCue, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+use+of+hydrophobic+interaction+chromatography+in+protein+purification+applications.">Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications.</a> Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).</li></ol>

选择色谱试剂和仪器的补充，Bio-Rad公司提供。

液相色谱技术已被证明为高度纯化的蛋白质，必要时进行免疫6，生化7，准备和结构8研究非常宝贵的。 HIC的净化方法往往需要经验的首选媒介的决心，并配体结构，配体密度，矩阵珠属性，所有已被证明影响色谱结果2，3。自动列侦察是一种有效的方法选择HIC的媒介，为后续的优化和蛋白质纯化4。自动列侦察方法可以很容易地适应各种HIC的蛋白质纯化策略。盐的浓度，选择盐，盐梯度和pH的变化可能进一步提高净化条件，改变这些基本参数的影响，此前已审查13,14。 HIC的洗脱液含有部分纯化的目标蛋白酶可以进一步纯化，利用互补的色谱技术，如离子交换层析（离子交换）或凝胶过滤/体积排阻色谱9,10。 由于其独特的光吸收和发射特性，GFP流出曲线可以使用行和运行后的方法确定。为此，该协议可以进一步进行调整重组绿色荧光蛋白融合蛋白的纯化，其中无关的靶蛋白与GFP的“标签”。 GFP标记的目标蛋白质，可以检测紫外线灯11和纯化采用各种色谱方法，包括如上所述的HIC纯化策略。 GFP的净化，也成为在现代蛋白质科学技术12教学生化实验室教学主食。 虽然使用大幅度减少稳健的色谱SY可以进行基本的HIC的蛋白质纯化干，这里介绍的仪器有一个明显的优势，以帮助取得了良好的效果。利用一个高度自动化的系统显着的好处包括：提高运行运行状况的可重复性，节省时间，并减少空气进入系统10推出的机会。系统控制的缓冲区的混合，这是由系统最大化的便利，允许增加缓冲区的准备和实验重复性的一致性。所有球探的动态样本循环吸引足够的样品负荷运行进一步确保被添加到每个列样品的均匀性，并允许连续运行不中断或手动重装。从样品到列循环控制进样降低变异可能发生的样品装载手册。双列选择阀允许连续样品运行，每次使用不同的抗HIC列，，无需，replumb系统。执行MUL<html> TI波长分析化验了一个独特的光度轮廓的一种蛋白质时特别有利。此外，以绿色荧光蛋白，细胞色素，黄素，和其他含血红素的蛋白质可能从这项技术中受益。电导率和pH监测设备允许实时实验条件的核查。分割分数洗脱收集允许改进的部分处理，使运行后的分析方法，需要一个最小的样品量（如酶联免疫吸附试验，SDS-PAGE电泳，免疫印迹和Experion微流体电泳）容易转移。第二部分收集脱机操作时需要手动同步，它允许最大的灵活性，馏分收集器的选择。 HIC的的球探列和蛋白质纯化利用这样一个强大的色谱系统最显着的缺点，包括初始时间和相关的预算支出与仪器购置和操作人员的培训。 T“这里提出的协议利用Bio-Rad公司DuoFlow层析系统。然而，也可以利用同样强劲，从其他制造商，如GE医疗ÄKTA前卫，仪表，能够产生相同的结果，甚至可以媲美色谱系统有独特的特点（如方法编程，组件的命名，运营商的偏好，和可扩展性的限制）前应考虑发起一个净化过程或仪器采集。

<table border="1"><tbody><tr><td>试剂名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>评论（可选） </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">生物DuoFlow探路者20系统</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td>包括系统的最大化，搅拌机，F10键工作站，AVR7-3阀，QuadTec紫外/可见光探测器流细胞，BioFrac的馏分收集，生物软件，入门套件</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8流选择阀</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td>高压阀门，9口，8位，3500 psi（233杆）的限制，使用生物DuoFlow系统</td></tr><tr><td>分流阀SV3T 2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> 7600410 </td><td>电磁阀，3端口，2位，30磅（2条）的限制，使用生物DuoFlow系统</td></tr><tr><td>流分配器阀</td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tical LSR与parentCategoryGUID的= 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba“目标=”_blank“&gt; DynaLoop 25套件</td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td>滑模活塞样品环套件，包括25的毫升DynaLoop滑动活塞循环，DynaLoop部分试剂盒（＃750-0450） </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">BioFrac馏分收集器</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td>两个分数山坳<html>讲师使用</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac微孔板下降头适配器</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac酶标板适配器</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td>国家=美国＆LANG = EN的productID = 741-0017“目标=”_blank“&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">紫外线光模块</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">卤素灯</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> &lt;<html>一目标=“_blank”&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo梯度泵</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td>梯度泵低压蛋白质纯化，包括油管和接头套件</td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion系统</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad？CMD = BRCatgProductDetail及产品ID = 224301“目标=”_blank“&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">的Experion Pro260分析套件</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">BIO-RAD</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap HIC的列选择套件</td><td> GE医疗集团</td><td> 28-4110-07 </td><td>包括7×1毫升HIC的媒体预包装侦察列</td></tr><tr><td> GE医疗的Bio-Rad公司色谱柱接头</td><td> GE医疗集团</td><td> 18111251和18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification

对比其他色谱法净化的蛋白质（如凝胶过滤，亲和，离子交换），疏水作用层析（HIC）通常需要实验测定（以下简称为筛查或“侦察”），以选择最合适的色谱介质为净化一个给定的蛋白质1。这里介绍的方法，介绍了自动化的方法，一个一个被用于蛋白质纯化的最佳HIC的媒体侦察。 HIC的蛋白质和其他生物大分子的分离从对疏水性的差异为基础的原油裂解。类似的亲和层析（AC）和离子交换色谱法（离子交换），HIC的是能够集中感兴趣的蛋白质，因为它通过色谱过程的进展。 HIC的最佳适合净化的蛋白质，包括那些与疏水表面区域，并能承受接触到盐浓度超过2米弹药钌硫酸（（NH 4）2 SO 4计 ）。 HIC的往往选择作为一个缺乏亲和标签蛋白的纯化方法，从而为AC不合适，当IEx未能提供足够的净化。对蛋白质表面的疏水基暂时绑定到非极性配体耦合的惰性，不动的矩阵。蛋白质和配体之间的相互作用是高度依赖流经层析柱缓冲盐浓度，离子浓度高，加强蛋白质-配体相互作用，使蛋白动（即列内的约束）2。随着盐的浓度下降，消耗的蛋白质 - 配体相互作用，蛋白质再次成为移动和流出列。 HIC的几个媒体市售预包装列，每几个疏水性配体（如S-丁基，丁基，辛基，苯基）包含一个交叉链接到一个规范的琼脂糖珠在不同密度IFIC直径3。自动列侦察允许一个有效的方法确定HIC的媒体应为未来，更详尽的优化实验和蛋白质纯化运行4。 特定的蛋白质纯化这里是重组绿色荧光蛋白（GFP）;然而，这种方法可用于净化与一个或多个疏水表面区域的其他蛋白质适应。绿色荧光蛋白作为一个有用的模型蛋白，由于它的稳定性，独特的光吸收峰在397 nm，荧光，当暴露在紫外线光5。准备在高盐缓冲含有野生型绿色荧光蛋白的细菌裂解液，装入一个Bio-Rad公司DuoFlow中型高压液相色谱系统，吸附到的HiTrap含有不同HIC的媒体HIC的列。蛋白被洗脱列，并在线路和运行后的检测方法分析。缓冲混合，动态样本循环注射，连续山坳UMN选择，多波长分析，并分割部分洗脱液收集增加了系统的功能和实验方法的重复性。

Watch this Scientific Journal Video about Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification at JoVE.com

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

提出了一个自动化的方法，确定合适的疏水作用层析（HIC）在蛋白质纯化过程中使用的媒体。该方法利用一个中型高压液相色谱系统包括自动缓冲混合，动态样本循环注射，顺序列选择，多波长分析，并分割部分洗脱液收集。

自动疏水层析蛋白质纯化用柱选择

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

automated-hydrophobic-interaction-chromatography-column-selection-for

Research

JoVE Journal

Biology

43.1K 次观看.  Seattle University. 提出了一个自动化的方法，确定合适的疏水作用层析（HIC）在蛋白质纯化过程中使用的媒体。该方法利用一个中型高压液相色谱系统包括自动缓冲混合，动态样本循环注射，顺序列选择，多波长分析，并分割部分洗脱液收集。