Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health di sovvenzione GM086822 e National Science Foundation importante ricerca strumentazione concessione DBI-0960313. Gli autori desiderano ringraziare Drs. Jon Hardy &amp; Donna Miyake (Bio-Rad) e Jennifer Loertscher (Seattle University) alla loro competenza tecnica. Selezionare reagenti cromatografia e strumentazione supplementare stati generosamente fornito da Bio-Rad.

<ol>
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Selezionare reagenti cromatografia e strumentazione supplementare sono stati forniti da Bio-Rad.

Tecniche di cromatografia liquida hanno dimostrato prezioso per la preparazione di proteine ​​altamente purificate necessari per lo svolgimento di 6 immunologica, biochimica 7 e 8 studi strutturali. Metodi di purificazione HIC più spesso richiedono determinazione empirica di un mezzo preferito, e la struttura ligando, densità di ligando, e matrice proprietà tallone tutti hanno dimostrato di impatto risultati cromatografici 2, 3. Colonna Automated scouting è un approccio efficace per la selezione di un mezzo di HIC per l&#39;ottimizzazione e la successiva purificazione di proteine ​​4. Il metodo automatizzato colonna esplorazione presentato può essere facilmente adattato alle strategie di varie proteine ​​HIC purificazione. Alterazioni concentrazione salina, scelta di sale, gradiente salino, e il pH può ulteriormente migliorare le condizioni di purificazione, e gli effetti delle variazioni di questi parametri essenziali sono stati precedentemente recensione 13,14. HIC eluato contenente una prote bersaglio parzialmente purificatoin può essere ulteriormente purificato utilizzando una tecnica cromatografica complementare, come cromatografia a scambio ionico (IEX) o gel filtrazione / cromatografia per esclusione dimensionale 9,10. A causa della sua assorbanza di luce unico e caratteristiche di emissione, il profilo di eluizione di GFP può essere identificato utilizzando in-linea e post-run approcci. A tal fine, questo protocollo può ulteriormente essere adattato per la purificazione di ricombinanti di fusione GFP-proteine, in cui una proteina bersaglio è correlato &quot;tag&quot; con GFP. Proteine ​​bersaglio GFP-etichetta può essere rilevato con luce UV 11 e purificato usando vari metodi cromatografici, compresa la strategia di purificazione HIC sopra descritto. Depurazione GFP è diventata anche un fiocco pedagogico nei laboratori di biochimica per l&#39;insegnamento di tecniche moderne della scienza delle proteine ​​12. Mentre base purificazione della proteina HIC può essere condotta utilizzando un sostanzialmente meno robusto cromatografia sygambo, la strumentazione qui presentata ha un numero di vantaggi distinti per aiutare a ottenere risultati favorevoli. Notevoli vantaggi di utilizzare un sistema altamente automatizzato includono il miglioramento delle run-to-run condizioni di riproducibilità, risparmio di tempo e diminuzione opportunità per l&#39;aria di essere introdotte nel sistema 10. Sistema di controllo miscelazione tampone, che viene facilitata dalla massimizzatore sistema, consente maggiore coerenza nella preparazione tampone e riproducibilità sperimentale. Disegno abbastanza carico campione nel ciclo del campione dinamico per tutti i scouting corre successiva garantisce l&#39;uniformità del campione che viene aggiunto ad ogni colonna e permette la replica in sequenza senza interruzioni o manuale ricarica. Iniezione del campione controllato dal circuito campione attraverso la colonna diminuisce variabilità che può verificarsi con caricamento manuale del campione. Una coppia di valvole di selezione di colonna per consentire corse campioni consecutivi, ciascuno utilizzando una colonna HIC differente, senza dover rinnovare gli impianti idraulici del sistema. Esecuzione di mul<html> ti-lunghezza d&#39;onda analisi è particolarmente vantaggioso quando saggiando una proteina con un unico profilo spettrofotometrico. Oltre a GFP, citocromi, flavoproteine ​​e altri eme contenenti proteine ​​possono beneficiare di questa tecnica. Dispositivi di controllo di conducibilità e pH per consentire la verifica delle condizioni sperimentali in tempo reale. Frazione collezione Split eluato consente una gestione migliore frazione e consente il trasferimento facile per Post-Run metodi di analisi che richiedono un volume minimo di campione (ad esempio ELISA, SDS-PAGE, western blot, e Experion elettroforesi microfluidica). Durante il funzionamento il secondo in linea collettore di frazioni richiede sincronizzazione manuale, permette la massima flessibilità nella scelta frazione collettore. Gli inconvenienti più significativi a utilizzare un sistema robusto cromatografia per la colonna HIC scouting e purificazione della proteina comprende il tempo iniziale e spese di bilancio connesse con l&#39;acquisizione dello strumento e la formazione degli operatori. t &quot;&gt; Il protocollo qui presentato utilizza un Bio-Rad DuoFlow sistema di cromatografia. tuttavia, strumentazione altrettanto robusto da altri produttori, come il Avant AKTA da GE Healthcare, possono anche essere utilizzati e sono in grado di produrre risultati equivalenti sistema di cromatografia Anche comparabile hanno caratteristiche uniche (ad esempio il metodo di programmazione, i limiti nomenclatura dei componenti, le preferenze dell&#39;operatore, e scalabilità) che devono essere considerati prima di avviare una procedura di purificazione o di acquisizione dello strumento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 Sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> Include il sistema di Maximizer, mixer, workstation F10, AVR7-3 valvole, QuadTec UV / Vis con rivelatore di cella di flusso, collettore di frazioni BioFrac, software BioLogic e starter kit </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8 stream-selezionare valvola</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> Valvola di alta pressione, 9-port, 8 posizioni, 3.500 psi (233 bar) limite, per l&#39;utilizzo con sistema biologico DuoFlow </td></tr><tr><td> Valvola deviatrice SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> 7600410 </td><td> Elettrovalvola, a 3 porte, 2-posizione, 30 psi (2 bar) limite, per l&#39;utilizzo con sistema biologico DuoFlow </td></tr><tr><td> Flusso splitter valvola </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>verticale = LSR &amp; parentCategoryGUID = &quot;target =&quot; 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba _blank &quot;&gt; DynaLoop 25 Kit </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> Sliding-pistone ciclo kit campione, include 25 ml DynaLoop scorrevole anello del pistone, DynaLoop parti kit (# 750-0450) </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">Raccoglitore di frazioni BioFrac</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> Due frazione col<html> lettori usati </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac micropiastra goccia adattatore testa</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac microtiter piastra di adattamento</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>&amp; Country = US &amp; lang = en &amp; ProductID = &quot;target =&quot; _blank 741-0017 &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">UV Ottica Module</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">Lampada alogena</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> &lt;<html> un target = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo Gradient Pump</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> Pompa gradiente a bassa pressione purificazione della proteina, comprende tubi e raccordi kit </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail &amp; ProductID = &quot;target =&quot; 224301 _blank &quot;&gt; 7.007.001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260 Analisi Kit</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap HIC colonna kit di selezione </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-4110-07 </td><td> Include 7 x 1 ml preconfezionati colonne di mezzi di HIC per scouting </td></tr><tr><td> GE Healthcare-to-Bio-Rad colonna raccordi </td><td> GE Healthcare </td><td> 18111251 e 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

automated hydrophobic interaction chromatography column selection for use in protein purification

A differenza di altri metodi cromatografici per proteine ​​purificante (gel ad esempio filtrazione, affinità, e scambio ionico), cromatografia di interazione idrofoba (HIC) richiede comunemente determinazione sperimentale (denominato screening o &quot;scouting&quot;) per selezionare il mezzo più adatto cromatografica per purificare una proteina dato 1. Il metodo qui presentato descrive un metodo automatizzato per scouting per un supporto ottimale HIC da utilizzare nella purificazione di proteine. HIC separa proteine ​​e di altre biomolecole da un lisato grezzo sulla base delle differenze di idrofobicità. Simile a cromatografia di affinità (AC) e cromatografia a scambio ionico (IEX), HIC è in grado di concentrare la proteina di interesse mentre avanza attraverso il processo cromatografico. Le proteine ​​più adatti per la purificazione da HIC sono quelli con le regioni superficie idrofoba e in grado di sopportare l&#39;esposizione a concentrazioni di sale in eccesso di 2 munizioni Mnio solfato ((NH 4) 2 SO 4). HIC è spesso scelta come metodo di purificazione di proteine ​​prive di una etichetta di affinità, e quindi inadatto per AC, e quando IEX non fornisce adeguata purificazione. Frazioni idrofobe sulla superficie della proteina temporaneamente legarsi ad un ligando non polare accoppiata ad un inerte, matrice immobile. L&#39;interazione tra proteina e legante sono altamente dipendenti dalla concentrazione salina del buffer che fluisce attraverso la colonna cromatografica, con alte concentrazioni ioniche rafforzamento della proteina-ligando e rendendo la proteina immobile (cioè vincolato all&#39;interno della colonna) 2. Come diminuzione delle concentrazioni di sale, la proteina-ligando dissipa, la proteina diventa nuovamente mobile e eluisce dalla colonna. Vari mezzi di HIC sono commercialmente disponibili in preconfezionati colonne, ciascuna contenente uno dei diversi ligandi idrofobi (ad esempio S-butile, butile, ottile, e fenil) reticolato a varie densità di perline di agarosio di una specificadiametro ific 3. Colonna di scouting automatizzato consente di adottare un approccio efficiente per determinare quali media HIC dovrebbe essere impiegato per i futuri, gli esperimenti di ottimizzazione più esaurienti e purificazione della proteina funziona 4. La proteina viene purificata specifico ecco ricombinante proteina verde fluorescente (GFP), tuttavia, il metodo può essere adattato per purificare altre proteine ​​con una o più regioni superficie idrofoba. GFP serve come una proteina modello utile, grazie alla sua stabilità, unico picco di assorbanza della luce a 397 nm, e la fluorescenza quando esposti a luce UV 5. Lisato batterico contenente GFP di tipo selvatico è stato preparato in un tampone ad alto sale, caricata in un Bio-Rad sistema mezzo cromatografia DuoFlow pressione del liquido, e adsorbiti colonne HiTrap HIC contenenti diversi supporti HIC. La proteina è stata eluita dalle colonne e analizzato in linea-e post-run metodi di rilevamento. Buffer blending, dinamica campione ansa di iniezione, col sequenzialeselezione UMN, multi-lunghezza d&#39;onda di analisi, e la frazione raccolta divisione eluato aumentato la funzionalità del sistema e la riproducibilità del metodo sperimentale.

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Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Un metodo automatizzato per identificare adatti cromatografia interazione idrofoba (HIC) mezzi da utilizzare nel processo di purificazione di proteine ​​viene presentato. Il metodo utilizza un sistema di media pressione cromatografia liquida compreso il miscuglio tampone automatizzata, dinamico ciclo di iniezione del campione, selezione di colonna sequenziale, multi-lunghezza d&#39;onda di analisi, e la frazione raccolta divisione eluato.

Automated interazione idrofobica colonna di selezione cromatografia per l&#39;utilizzo in purificazione di proteine

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

automated-hydrophobic-interaction-chromatography-column-selection-for

Research

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Biology

43.1K Views.  Seattle University. Un metodo automatizzato per identificare adatti cromatografia interazione idrofoba (HIC) mezzi da utilizzare nel processo di purificazione di proteine ​​viene presentato. Il metodo utilizza un sistema di media pressione cromatografia liquida compreso il miscuglio tampone automatizzata, dinamico ciclo di iniezione del campione, selezione di colonna sequenziale, multi-lunghezza d'onda di analisi, e la frazione raccolta divisione eluato.