这种方法可以很容易地适应观察来自其他荧光蛋白的信号，或可用于成像轴子在其他成人中。这种技术的主要优势有助于轴子及其终端轴的出色的三维重建和可视化。首先用70%乙醇在玻璃多孔板中填充适当数量的井。用刷子将15至20种任何年龄或性别的二氧化碳麻醉苍蝇添加到每口井中，然后轻轻地将苍蝇放入乙醇中，直到它们完全被淹没。
不超过一分钟后，用磷酸盐缓冲盐水中的0.3%非离子表面活性剂洗涤剂溶液冲洗苍蝇三次，每次洗涤至少10分钟。最后一次洗涤后，用钳子去除每只苍蝇的头部和腹部，而不损坏胸段或腿部，并使用一对细钳的尖端轻轻地，但牢牢地施加压力到考克斯胸结，以分离一条腿从胸段。将腿部放在新多井板的一个井中，在冰上含有新鲜准备好的4%甲醛，在4摄氏度下过夜孵育。
重要的是轻轻地将腿推入固定缓冲液，而不让它们漂浮以获得固定良好的腿。第二天，用新鲜0.3%的非离子表面活性剂洗涤剂溶液洗腿五次，每次洗涤20分钟。上次洗涤后，用安装介质更换洗涤剂，将腿部保持至少 24 小时。
第二天，在玻璃显微镜幻灯片的涂层端旁边加入约20微升70%甘油，用22到22毫米盖玻片覆盖甘油。接下来，在盖玻片右侧加入约 10 微升的安装介质系列，并在 10 微升线右侧应用第二条 30 微升安装介质。使用精细钳子，将一条腿从多孔板以介质滴向外部上、下方向的 10 微升安装介质条。
重复，直到六到八条腿被安装和对齐，并在腿上放置第二个盖玻片，使第二个盖玻片稍微放在第一个盖玻片上。然后在盖玻片的每个角落使用指甲油，以确保它们就位。要成像腿部，请同时使用 488 纳米激光器和两个探测器设置第一个轨道，以获得 GFP 和角质层自动荧光。
选择 20 到 25 倍的油浸目标，将分辨率设置为 1024 x 1024 像素，深度为 12 位，将 z 间距设置为 1 微米。将幻灯片加载到显微镜阶段，并使用相同的激光功率对两个探测器，调整第一个探测器的增益以获得明亮的 GFP 信号，并调整第二个探测器，以确保某些具有高角质层信号的区域在此探测器中产生饱和信号。然后，如果腿已伸出或太大，无法在单个帧中成像，则使用磁贴或位置选项对腿进行图像图像。
对于图像处理，请打开 ImageJ 斐济中的共生堆栈，并使用 Bio 格式插件打开任何非 TIFF 格式的图像。要拆分通道，请选择"图像、颜色"和"分割通道"。要从 GFP 信号中减去角质层信号，请打开"过程"和"图像计算器"，并从探测器中选择堆栈作为图像一。
在操作窗口中，选择从探测器二中减去轨道作为图像二，以便只获得内源性 GFP 信号。使用图像、堆栈、Z 保护为内生 GFP 信号生成最大强度投影。使用亮度控制窗口中的控件调整亮度和对比度。
然后生成角质层的平均强度，然后是图像、颜色和合并通道，以将 GFP 堆栈与从探测器 2 获得的仅角质层堆栈合并回来。这将导致由组织特异性 GFP 信号以及角质层信号组成的 RGB 图像，以帮助识别腿部段内的轴孔轴。要使用宏，请打开共和堆栈，然后单击"图像、调整"和"亮度/对比度"。
然后单击"插件"和"宏运行"以运行宏并按照说明操作。当要求在图像计算器窗口中指定操作时，请选择图像 1 作为堆栈 1。在操作窗口中，选择"减法"。
选择图像二作为堆栈二。当被要求调整对比度时，使用亮度控制窗口中的控件调整 GFP 最大投影图像和角质层平均投影的亮度对比度，以生成显示绿色 GFP 和灰色角质层两个信号的 RGB 合并图像。然后合并堆栈 1 和堆栈 2 的结果，生成可以在下一阶段使用的组合 GFP 和角质层堆栈。
要以三维方式可视化腿部，请打开相应的 3D 软件程序中的 RGB 堆栈。在弹出式对话窗口中，选择模式转换部分中的所有通道，并输入从上一分析中获得的体子的大小。在通道一模块中，右键单击并选择"显示"和"Volren"。
然后左键单击 Volren 模块。在"属性"部分中，左键单击"高级"并选择 DDR。然后调整伽玛值以查看角质层背景。
在通道二模块中，右键单击并选择"显示卷"。然后左键单击 Volren 模块，编辑并选择 VolrenGreen.col。使用此过程，来自角质层的信号可以与 GFP 信号结合，以识别轴在腿部内的定位。
获得固定良好的腿是至关重要的。在正确固定的腿，腿内的内部结构是统一的颜色和气管，这是黑暗的，是可见的。在固定不良的腿部，暗物质存在于焦油和头骨中，气管系统在股骨和考克斯中不清晰可见。
我们在这里描述的程序克服了通过高分辨率的厚和自动荧光角质层检测运动神经元轴子中荧光表达的挑战。因此，获得的干净和详细的荧光信号使我们能够使用三维成像程序可视化和量化轴翁树干的三维特征。因此，这项技术将使我们能够使用成人果蝇作为模型，不仅研究运动神经元的发展，而且研究，了解退行性疾病，如 ERAS 对运动系统集成的影响。
