这项工作是由冰岛研究基金和冰岛大学的研究基金资助。

1。转分子克隆两个质粒，p8XSp5 - EGFP和p67r 12 KB和450 KB，分别载于9,10。 <ol><li>剪下的两个质粒，即4.4微克p8XSp5 - EGFP转染前用XbaI和结扎和1.6微克p67r摩尔数量。 </li><li>结扎，使用50μl反应体系，在16 ° C过夜孵育1魏斯单位的连接酶。 </li><li>当结扎完成后，在65℃孵育15分钟连接酶失活结扎组合。这一步可以省略。 </li><li>转染前两天，种子10 6 SCP的细胞在T25组织培养瓶中，并成长为这两天在5毫升的DMEM + 10％，羊肉和血清2MM谷氨酰胺抗生素而不到90％汇合单层细胞。如果细胞都没有达到90％汇合，两天后离开的细胞生长额外增加的一天。 </li></ol>注意：羊肉血清胎牛血清（FBS），可以取代。我们经常使用的羔羊血清，因为某些菌株的MVV FBS的抑制;这MVV应变是不抑制胎牛血清，但是。 <ol start="5"><li>当细胞转染，改变1％血清的培养基（羊肉血清或胎牛血清）的DMEM无抗生素。 我们用脂质体转染2000（Invitrogen）的。 </li><li>在500μL的Opti - MEM培养基稀释的DNA。 </li><li>在500μL的Opti - MEM培养基稀释20μL脂质体2000，并在室温（RT）5分钟离开。 </li><li> 5分钟孵育后，用稀释的脂质体2000（总体积= 1000μL）稀释的DNA结合。轻轻混匀，并培育在室温为20-30分钟。 </li><li> T25烧瓶中包含SCP的细胞和介质（5毫升）加入转染混合物（1毫升）。摇摆轻轻混合。 </li><li> 37 ° C和5％的CO 2晚（18 - 24小时） 。 </li><li>用1％的血清，2MM谷氨酰胺，青霉素100IU和100IU链霉素变化中DMEM翌日。 </li><li>监控生产绿色荧光蛋白在SCP细胞，倒置荧光显微镜。可以预计，随着这些主要细胞，一般为5 - 15％的转染效率低。 </li><li>在37进一步℃，5％的CO 2几天烧瓶中，允许病毒的蔓延。它通常需要7-14天完全感染。 </li><li> aliquoting Eppendorf管中的上清液的收获病毒。旋转5分钟3000转，在一个离心去除细胞碎片。转移上清含有病毒新管。储存在-80 ° C。 </li></ol> 2。滴定病毒<ol><li>种子在100μL的DMEM培养基中血清10％，2MM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素，每孔在96孔板3x10 4 SCP的细胞。在37℃，5％的CO 2。 </li><li>翌日，如果细胞融合，改变培养基DMEM培养液与1％血清，谷氨酰胺2MM，100IU/ml青霉素，链霉素100IU/ml，100μL，每孔。 </li><li>稀释下列方式病毒： <ol><li>添加1％血清DMEM培养液180μL，2MM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素每孔4 × 10井在96圆底或V型底板。 </li><li>一式四份串行十倍稀释，加20μL病毒4wells在该板块的第一列，并使用一个四道移液器，移液器上下，以确保样品充分混合。更改枪头和20μL转移到接下来的4口井等。离开病毒阴性对照去年井。 </li></ol></li><li>添加100μL病毒稀释到SCP细胞和介质。 </li><li>孵育37 ° C和5％的CO 2。 GFP荧光和细胞病变的影响，观察了两个星期。 细胞病变的影响变得圆润小于伸出过程中的正常细胞的透明度，以多核细胞和细胞死亡结束的细胞组成。 </li><li>计算病毒滴度（TCID50）使用的Reed Muench法11。 </li></ol> 3。流式细胞仪检测感染细胞的注：对于病毒的复制快速监测，受感染的细胞可通过流式细胞仪检测。 <ol><li> Trypsinize（约10 5）感染的细胞，用PBS重悬在500μLPBS洗1X。 </li><li>添加500μL，4％多聚甲醛溶液（2％终浓度），在室温下孵育30分钟。 </li><li>在5分钟3000转离心沉淀细胞。 </li><li> 2X5分钟，用PBS清洗和上FACScan分析仪进行分析。计数10,000个事件。 </li></ol> 4。代表性的成果： 这种病毒应该充分感染和复制滴度的10月6日 - 10 7 TCID 50 / ml的。感染的细胞荧光和可DETected流式细胞仪和荧光显微镜。通常情况下，GFP可以检测到超过60％被感染的细胞，用流式细胞仪（图1）文化细胞。同样，荧光显微镜观察时，大多数细胞荧光（图2A和B）。 <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。FACScan分析，感染后7天的SCP KV1772 - EGFP病毒感染的细胞。 <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。阶段KV1772 - EGFP感染后7天的潜伏期（一）SCP细胞的显微镜。相同的细胞荧光显微镜（二）可视化。

<ol>
	<li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna,+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep.">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li><li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes.">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li><li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus.">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li><li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep:+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence.">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li><li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions.">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li><li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity.">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li><li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture.">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li><li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein.">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li><li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus.">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li><li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype.">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li><li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus:+analysis+of+virus+production+and+infectivity.">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

这里介绍的MVV分子克隆的GFP表达，应有助于分析宿主细胞相互作用，并在体外和体内的MVV的致病性。复制后7-14天获得的病毒无疑已经收购了一些由于不准确的逆转录的突变。不过，也有作为一个周期载体使用这个克隆的限制。其中之一是限制使用克隆绵羊和山羊的起源细胞。使用我们的构造，这些细胞的转染效率只有5-15％，和使用的pEGFP - N3载体转染效率是15-20％相比，超过90％，使用293 - T细胞?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td></tr><tr><td> DMEM培养液</td><td> Gibco公司</td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> OPTI - MEM </td><td> Gibco公司</td><td> 51985018 </td></tr><tr><td>脂质体2000 </td><td> Invitrogen公司</td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein

Maedi visna病毒量（MVV）是一个羊的慢病毒，引起缓慢渐进的间质性肺炎和脑炎1。体内的MVV的主要靶细胞被认为是单核细胞谱系2。某些菌株的MVV可以复制在其他类型的细胞，但是3,4。绿色荧光蛋白是一种常用的标记用于研究活细胞的慢病毒。我们有MVV dUTPase基因插入的EGFP基因。 dUTPase基因是保守的绵羊和山羊的最慢病毒株，并已被证明是在复制 CAEV 5重要。然而，dUTPase已被证明在此研究在体外和体内6使用的MVV分子克隆复制可有可无。 MVV复制是严格限制的绵羊或山羊的起源细胞。我们利用转染和传播病毒的7主要从羊的脉络丛（SCP的细胞）的细胞株。荧光灯的MVV完全传染病和EGFP表达稳定至少6通道8。 TCID 50和EGFP的测量之间有良好的相关性。因此，这种病毒应该被感染细胞的快速检测 8，在体外和体内的细胞嗜性和致病性的研究非常有用。

Watch this Scientific Journal Video about Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

我们描述了一个maedi visna病毒的分子克隆，表达GFP和充分传染病。这种病毒的复制，可以通过使用荧光显微镜和流式细胞仪检测。

宣传和检测Maedi visna病毒传染性表达绿色荧光蛋白的分子克隆

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

propagating-detecting-an-infectious-molecular-clone-maedi-visna-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K 次观看.  University of Iceland. 我们描述了一个maedi visna病毒的分子克隆，表达GFP和充分传染病。这种病毒的复制，可以通过使用荧光显微镜和流式细胞仪检测。