Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Pesquisa da Islândia e da Universidade da Islândia Fundo de Investigação.

1. Transfecção O clone molecular está contida em dois plasmídeos, p8XSp5-EGFP e p67r, de 12 kb e 4,5 kb, respectivamente. 9,10 <ol><li> Corte quantidades equimolares dos dois plasmídeos, ou seja, 4,4 mg de p8XSp5-EGFP e 1,6 mcg de p67r com XbaI e ligar antes de transfecção. </li><li> Para a ligadura, use uma unidade de Weiss de ligase em uma reação de 50 ul e incubar a 16 ° C durante a noite. </li><li> Quando a ligadura é completada, incubar a mistura de ligadura a 65 ° C por 15 min para inativação da ligase. Este passo pode ser omitido. </li><li> Dois dias antes de semente de transfecção, 10 6 células SCP num frasco de cultura de tecidos T25, e cultivar células por dois dias em 5 ml DMEM + 10% de soro de carneiro e glutamina 2mM sem antibióticos para uma monocamada de 90% confluência. Se as células não tiverem alcançado 90% confluência depois de dois dias, deixar as células a crescer um dia adicional. </li></ol> Nota: O soro de cordeiro pode ser substituído por soro fetal bovino (FBS). Nós usam rotineiramente cordeiro soro, uma vez que algumas cepas de MVV são inibidas por FBS; esta estirpe MVV não é inibida por FBS, no entanto. <ol start="5"><li> Quando as células estão prontos para a transfecção, as alterações médio e DMEM com soro 1% (soro ou cordeiro FBS) sem antibióticos. Usamos Lipofectamin 2000 (Invitrogen) para transfecção. </li><li> Diluir o DNA em 500μl médio Opti-MEM. </li><li> Diluir 20μl Lipofectamin 2000 em 500μl médio Opti-MEM e deixe em temperatura ambiente (RT) por 5 min. </li><li> Após a incubação de 5 minutos, misture o DNA diluído com Lipofectamine diluída 2000 (volume total = mL 1000). Misture delicadamente e incubar por 20-30 min em temperatura ambiente. </li><li> Adicione a mistura de transfecção (1 ml) para o frasco contendo células T25 SCP e médias empresas (5 ml). Mix movimentando-se suavemente. </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 durante a noite (18-24 h). </li><li> Mudar o dia do meio a seguir para DMEM com soro 1%, 2mM de glutamina, penicilina e estreptomicina 100IU 100IU. </li><li> Monitorar a produção de GFP em células SCP por microscopia fluorescente invertido. Eficiência de transfecção baixo pode ser esperado com essas células primárias, geralmente 5-15%. </li><li> Incubar mais tempo, a 37 ° C, 5% CO 2 por vários dias para permitir a propagação do vírus no frasco. Ele normalmente leva 7-14 dias para a infecção por completo. </li><li> Recolher o vírus por alíquotas do sobrenadante em tubos Eppendorf. Girar em uma microcentrífuga a 3000 rpm por 5 min para remover restos celulares. Transferir o sobrenadante contendo o vírus para novos tubos. Armazenar a -80 ° C. </li></ol> 2. Titulação do vírus <ol><li> Semente de 3x10 4 células SCP em 100 mL meio DMEM suplementado com soro de 10%, a glutamina 2mM, penicilina e estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, por bem em uma placa de 96 poços. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Se as células são confluentes no dia seguinte, a mudança médio e DMEM com soro 1%, a glutamina 2mM, penicilina e estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, 100 l em cada poço. </li><li> Diluir o vírus da seguinte forma: <ol><li> Adicionar 180 mL DMEM com soro 1%, 2mM de glutamina, penicilina e estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml por poço de 4 x 10 poços em um fundo de 96 poços redondos ou V-bottom prato. </li><li> Para diluições em série de dez vezes em quatro vias, adicionar 20 mL de vírus a cada um dos 4wells na primeira coluna da placa, e usando uma pipeta de quatro canais, pipeta cima e para baixo para garantir que as amostras sejam bem misturados. Trocar a ponteira e transferir 20 l para os próximos quatro poços e assim por diante. Deixe o passado sem poços de vírus para controle negativo. </li></ol></li><li> Adicione 100 ml das diluições do vírus às células SCP e médias empresas. </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% CO 2. Observe para GFP fluorescência e efeitos citopáticos por duas semanas. Efeitos citopáticos são constituídas por células arredondadas e tornando-se menos transparentes do que as células normais com os processos que se estende para fora, terminando com as multinucleares aparecendo e morte celular. </li><li> Calcule vírus título (TCID50), utilizando o método Reed Muench 11. </li></ol> 3. FACS análise de células infectadas Nota: Para o monitoramento rápido de replicação do vírus, as células infectadas podem ser examinadas por citometria de fluxo. <ol><li> Trypsinize células infectadas (10 ca 5), lavar com PBS 1x e ressuspender em 500μl de PBS. </li><li> Adicionar 500 mL de solução de paraformaldeído 4% (2% de concentração final), incubar a RT por 30 min. </li><li> Células sedimento em uma microcentrífuga a 3000 rpm por 5 min. </li><li> Lavar com PBS 2x5 min e analisar em um analisador FACScan. Contagem de 10.000 eventos. </li></ol> 4. Resultados representativos: Este vírus devem ser totalmente infecciosas e replicar a um título de 10 junho - 10 julho TCID 50 ml /. Células infectadas são fluorescentes e pode ser detected por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Tipicamente, GFP pode ser detectada em mais de 60% das células em cultura de células infectadas por citometria de fluxo (Fig. 1). Da mesma forma, quando visualizados por microscopia de fluorescência, a maioria das células são fluorescentes (Fig. 2A e B). <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. FACScan análise de células infectadas com o SCP KV1772-EGFP vírus após 7 dias de infecção. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Microscopia de contraste de fase de células infectadas com o SCP KV1772-EGFP após 7 dias de incubação (A). Mesmas células visualizadas por microscopia de fluorescência (B).

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	<li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna,+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep.">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li><li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes.">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li><li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus.">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li><li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep:+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence.">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li><li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions.">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li><li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity.">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li><li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture.">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li><li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein.">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li><li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus.">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li><li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype.">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li><li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus:+analysis+of+virus+production+and+infectivity.">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A GFP expressar clone molecular de MVV aqui apresentados deve ser útil para analisar as interações da célula hospedeira e patogenicidade do MVV tanto in vitro como in vivo. O vírus obtidos após 7-14 dias de replicação, sem dúvida, adquiriu algumas mutações devido à imprecisão da transcriptase reversa. No entanto, existem limitações para o uso deste clone como um vetor único ciclo. Uma delas é que o uso do clone é restrita a células de ovelhas e cabras de origem. A eficiência de transfecção destas c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

propagating and detecting an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein

Maedi-visna (MVV) é um lentivírus de ovelhas, fazendo com que lentamente progressiva pneumonia intersticial e encefalite 1. As células-alvo primário do MVV in vivo são consideradas das duas linhagem de monócitos. Determinadas estirpes de MVV pode replicar em outros tipos de células, no entanto 3,4. A proteína verde fluorescente é um marcador comumente usado para estudar lentivírus em células vivas. Temos inserido o gene EGFP no gene para dUTPase de MVV. O gene dUTPase está bem conservado em cepas mais lentivírus de ovinos e caprinos e tem se mostrado importante na replicação do CAEV 5. No entanto, dUTPase foi mostrado para ser dispensáveis ​​para a replicação do clone molecular de MVV utilizados neste estudo in vitro e in vivo 6. Replicação MVV é estritamente confinada às células de ovelhas ou cabras origem. Nós usamos uma linhagem de células primárias do plexo coróide de ovelhas (células SCP) para transfecção e propagação do vírus 7. O MVV fluorescentes é totalmente infecciosas e expressão EGFP é estável durante pelo menos seis passagens 8. Há boa correlação entre as medidas de TCID 50 e EGFP. Este vírus deve ser útil para a detecção rápida de células infectadas em estudos de tropismo celular e patogenicidade in vitro e in vivo 8.

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Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Nós descrevemos um clone molecular da Maedi-visna vírus que expressa a GFP e é totalmente infecciosas. Replicação deste vírus pode ser detectado por meio de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

Propagação e detecção de um Clone Infecciosas Molecular da Maedi-visna vírus que expressa a proteína fluorescente verde

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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