支持我们的工作是由瑞士国家科学基金会（民阵），瑞士在系统生物学（SystemsX.ch），美国肌肉萎缩症协会（MDA）含量，协会法国驳LES​​肌病（AFM），美国线粒体疾病基金会倡议（UMDF的），Gebert联阵基金会罕见疾病计划（GRF），瑞士肌肉疾病（SSEM / FSRMM），瑞士人寿“Jubiläumsstiftung献给Volksgesundheit和medizinische Forschung”，罗氏研究基金会和大学的研究学会巴塞尔。

1。小学人体肌肉细胞培养制备<ol><li>建立人体肌肉细胞培养根据对explantation重新explantation的技术4。首先，从非肌肉组织活检的。然后，嵌入在血浆凝块，这使得从外植体成纤维细胞出现1毫米3肌肉植。 </li><li>嵌入植体转入明胶等离子涂层菜，让他们在正常生长介质中成长（的MEM 25％，中型199，10％小牛血清[胎牛血清，1％青霉素/链霉素，10μg/ ml的胰岛素，补充10 ng / ml的重组人表皮生长因子，表皮生长因子]，12.5 ng / ml的人类成纤维细胞生长因子[成纤维细胞生长因子）在单层。出现在这些条件下，从植细胞，肌肉细胞。这些细胞外植体取出后，将继续增长单层。 </li><li>文化aneurally 0.1％明胶涂层板在正常生长介质的细胞。这些细胞可以aneurally培养和扩增的需要。最好是在3日和8之间的通道使用的肌肉细胞进行联合培养。这是至关重要的支配年轻的肌管;这一点后，共同的文化有一个失败的高风险。此外，肌管不宜过大，过厚。 </li><li> 35毫米组织培养皿密度每盘50细胞的正常生长培养基（或6孔板）支配计划的前两天，盘上的肌肉细胞。在密度，细胞在适当的汇合于翌日开始融合，一天之后，随后的支配。利用这些条件，肌管是最佳的支配和纤维收缩，因此后续在合适的阶段。 </li><li>第二天，组成一个融合的MEM培养基辅以25％，中型199，5％胎牛血清，10μg/ ml的胰岛素，1％青霉素/替换中的正常生长介质。 </li></ol> 2。 isolati<html>大鼠胚胎脊髓植在双目显微镜下进行隔离脊髓外植体的整个过程，在汉克的含10％胎牛血清（FBS），平衡盐溶液（HBSS中，GIBCO / Invitrogen公司的14170号）。 <ol><li>大鼠胚胎ED 13日和14日之间有不同的发展阶段，将危及整个过程，这是至关重要的。牺牲与CO 2的怀孕妇女，并收集在HBSS中型全胚胎链。隔离每个胚胎和安乐死斩首。 </li><li>在一块休息的身体从解剖胚胎脊髓和消除周围的肌肉和结缔组织。必须非常小心，以保持连接到脊髓，以确保功能的神经支配的背根神经节（病种付费）。 </li><li>每个脊髓横向切片的方式，每个外植体包含至少2个（1毫米3植）连接到它的背根神经节。 </li></ol><html> ove_title“&gt; 3。支配人体肌肉细胞的胚胎大鼠脊髓植<ol><li>去除肌肉细胞培养融合的媒介，留在单层的中型精细层。 </li><li>将外植体对肌肉细胞层，每35毫米盘5个均匀分布的植仔细。 </li><li>新增很缓慢，下降到每个外植体，融合媒介明智的。这是需要添加肌肉细胞的媒介生存，但不能太多，让植坚持先与细胞接触。如果媒体不加正确（太强烈或过多介质），外植体漂浮，将无法支配肌肉细胞。 </li><li>一旦植开始坚持，顶部的融合中等至2毫升每35毫米的菜，放菜，非常仔细地进入孵化器。 </li></ol> 4。异种神经肌肉文化的维护<ol><li>改变的融合中每周两次。 </li></ol>_title“&gt; 5代表结果。 只要两天后的支配，这是可以看到突起，每个外植体和新兴的按钮状结构（ 图1）所代表的肌肉细胞，建立联系。 早4-6天的支配后，个别纤维将开始合同。 宫缩持续许多个月，维持简单地通过改变培养基每周两次。 约2周后，脊髓外植体本身的退化，但保守的支配。这是正常的。罚款的神经元件层停留在表面的肌肉细胞层。这种神经网络是不足以维持电机单元的功能。 如果外植体漂浮在中期的一天支配后，他们将永远坚持。这种情况发生时肌肉细胞层没有充分融合，或当介质添加过于粗略。有时，会出现植坚持，但没有突起。这可能是由于缺乏连接到它的背根神经节。的支配，以及在这种情况下，将不能成立。操纵的菜肴，非常仔细的第一周，为外植体仍然可以容易分离。交换的融合媒体，用最小的速度增加液滴明智地避免细胞脱落。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3616/3616fig1.jpg" /> 图1。脊髓植肌细胞培养至15天从第一天的合作。

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	<li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions.">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li><li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord:+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation.">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li><li>Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+muscular+abnormalities+in+culture+in+spinal+muscular+atrophy.">Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy.</a> Lancet. 345, 694-695 (1995).</li><li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture.">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li><li>Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+required+to+efficiently+innervate+human+muscle+cells+in+vitro.">Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro.</a> Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).</li><li>Lefebvre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+spinal+muscular+atrophy-determining+gene.">Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.</a> Cell. 80, 155-165 (1995).</li><li>Schrank, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+survival+motor+neuron+gene,+a+candidate+gene+for+human+spinal+muscular+atrophy,+leads+to+massive+cell+death+in+early+mouse+embryos.">Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).</li><li>Hsieh-Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy.">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).</li><li>Monani, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+centromeric+survival+motor+neuron+gene+(SMN2)+rescues+embryonic+lethality+in+Smn(-/-)+mice+and+results+in+a+mouse+with+spinal+muscular+atrophy.">The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).</li><li>Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+mouse+models+to+understanding+the+pathogenesis+of+spinal+muscular+atrophy.">The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy.</a> Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).</li><li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex:+an+overview+of+current+mouse+models.">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li><li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Standard+model.">Neuroscience: Standard model.</a> Nature. 454, 682-685 (2008).</li><li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS.">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li><li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system.">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li><li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically:+relevance+to+inclusion-body+myopathies.">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li></ol>

我们什么都没有透露。

生理体外的工具来研究肌肉细胞的功能，在正常和病理情况下是最高的myologists的利益，因为肌肉细胞培养不重述多种细胞和细胞类型连接的重要性的。增加肌肉细胞纯化的运动神经元是不够的，因为雪旺氏细胞的存在是必需的支配有效率5，它不是拓扑（3D +特约经销）有关的协议描述这里实现功能的运动单位被成功地用于建立神经支配的肌肉细胞， 在体外和在一个完整的NMJ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td></tr><tr><td> HBSS中</td><td> GIBCO / Invitrogen公司</td><td> 14170 </td></tr><tr><td>的MEM </td><td> GIBCO / Invitrogen公司</td><td> 31095 </td></tr><tr><td>中等199 </td><td> GIBCO / Invitrogen公司</td><td> 31153 </td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>胚胎克隆Perbio </td><td> SH30066.03 </td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>西格玛</td><td> I9278 </td></tr><tr><td>人类表皮生长因子</td><td>西格玛</td><td> E9644 </td></tr><tr><td>人类FGF </td><td>硅GMA </td><td> F0291 </td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td> Gibco公司</td><td> 15140 </td></tr></tbody></table>

a functional motor unit in the culture dish: co-culture of spinal cord explants and muscle cells

人类的主要肌肉细胞单层培养aneurally很少自发的，因为在一个神经组件的情况下，细胞分化是有限的和运动神经元的刺激，失踪1人的合同。这些限制妨碍在体外培养的肌肉细胞中的许多神经肌肉疾病的研究。重要的是，单层，培养肌细胞的实验限制是可以克服的功能神经支配的肌纤维与脊髓外植体，在联合培养。 在这里，我们实现了高效，正确支配人类的主要肌肉细胞所需的不同步骤，根据Askanas 2开发的方法，导致完成分化和纤维收缩。这样做，肌肉细胞共同培养大鼠胚胎脊髓植13.5海关，背根节还连着脊髓切片。几天后，肌肉FIBERS开始合同，并最终成为通过支配跨横纹肌从外植体，连接到肌肉细胞的脊髓投射功能的突起。这种结构可以维持很多个月，只需定期交流培养基。 这宝贵的工具的应用有很多，因为它代表了一种对人体肌肉的发展和支配的多学科分析的功能模型。事实上，一个完整的从头神经肌肉交界处安装发生在培养皿中，让每一步，从根本上和生理范围内，一个容易的多参数测量。 只是举出几个例子，基因和/或蛋白质的研究，可以直接进行联合培养。此外，前和突触后的效果可以明确，并分别在神经肌肉接头处评估，从不同的物种，因为这两个组件，老鼠和人，分别为。共培养神经肌肉也可以从肌肉或神经肌肉疾病患者分离出人体肌肉细胞进行，因而可以作为候选药物的筛选工具。最后，没有特殊的设备，但需要定期BSL2设施重现功能的运动单位在培养皿。因此，这种方法是有价值的肌肉以及肌肉神经肌肉功能的生理和机理研究研究社区，在正常和疾病的情况下。

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A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

体外培养肌细胞是不够的模型来概括神经支配的肌肉<em&gt;在体内</em&gt;。可以复制功能的运动单位<em&gt;在体外</em&gt;分化人类的主要肌肉细胞用鼠胚胎脊髓植支配。本文介绍了如何建立脊髓植和肌肉细胞共培养。

一个在培养皿中的功能电机组：脊髓植和肌肉细胞共培养

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

a-functional-motor-unit-culture-dish-co-culture-spinal-cord-explants

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Neuroscience

15.2K 次观看.  University of Basel. 体外培养肌细胞是不够的模型来概括神经支配的肌肉在体内。可以复制功能的运动单位在体外分化人类的主要肌肉细胞用鼠胚胎脊髓植支配。本文介绍了如何建立脊髓植和肌肉细胞共培养。