鸡胆结，是一种结构局部在眼睛的后部，毗邻视神经中的胆状裂变。而胆结神经元，属于寄生神经系统，是胆碱性神经元，因此可以建立胆碱性突触。胆结由大量的胆碱神经元和胆状神经元组成，这些神经元在结构和功能上是截然不同的。
因此，胆小血管内增强眼内肌肉，胆腺神经元内侧增强眼睛的情绪肌肉。在培养的第一天，硅突神经元呈现多极形态，在此之后，它们开始过渡到单极状态，其中一个中性体延伸并形成轴突。使用胆结神经元的最常见的研究之一是研究神经肌肉突触，这是胆碱性突触，与以前的模型相比，使用胆结神经元已成为一个很好的选择，因为获得的神经群，是同质的，因为所有的神经元都是胆碱性，因此它们可以建立功能突触与肌肉细胞， 这不会发生， 当我们与神经元群体， 这不是完全胆碱。
对首次做这种活体的人来说，对丝体结节的识别和解剖可能相当具有挑战性，因此，在这里，我们提供一个循序渐进的协议，用于适当识别和解剖 cilis 结节，以及这些神经元成功培养的指南。对于表盖玻片的制备，您需要 13 毫米玻璃盖玻片、耐酸容器、65% 硝酸、钳子、Milli-Q 水、75% 乙醇和轨道摇床。为初级培养物准备盖玻片，应在程序前两天完成。
将所需数量的玻璃盖玻片放在耐酸容器内，并加入 65% 的硝酸，直到覆盖所有盖玻片。将容器放在轨道摇床中，并在室温下孵育过夜。搅拌。第二天，小心地去除硝酸，并星重新使用。
清洗盖玻片，将美利 Q 水添加到容器中。再次，放置搅拌 30 分钟，丢弃洗涤溶液，并重复此过程 5 次。使用 75% 乙醇冲洗盖玻片两次。
小心地将单个盖玻片分离并放在金属架上，用铝箔覆盖，并在 50 度下孵育 10 至 15 分钟，或直到完全干燥。在紫外光下对盖玻片进行消毒，10 至 15 分钟。对于覆盖唇，您将需要，无菌玻璃盖玻片，24井板，无菌钳子，0.1毫克每毫升PDL溶液，无菌水，10微克每毫升层压溶液，普通神经基础介质，和硅丝结节完整的介质。
盖玻片的涂层应在手术前一天完成。使用无菌钳子，在24井板的每个井中放置一个盖玻片，加入500微升聚透析溶液，浓度为每毫升0.1毫克，并在37度孵育过夜。第二天，用无菌水洗三次盖玻片，丢弃水，并添加350微升的层压溶液，每毫升浓度为每毫升10微克。
放在孵化器里，在37度处放置两个小时。在此时间之后，在细胞电镀之前，取出层压素溶液，用300微升普通神经基础介质洗涤两次。添加300个全介质的微升，并放在孵化器中，在37度和5%CO2，直到你准备好板细胞。
对于解剖程序，您将需要，鸡蛋在胚胎第7天，75%乙醇，解剖钳号545和数字55，剪刀，勺子，解剖培养皿与黑底和冰冷的HPSS溶液。确保用75%乙醇消毒所有解剖工具。鸡蛋应储存在16度，然后孵育在卵子孵化器中，在37.7度，7天，或其他所需的胚胎阶段。
在手术当天，从培养箱中取出鸡蛋，用75%乙醇喷洒鸡蛋。用剪刀把鸡蛋放在上面，用勺子小心地取出蛋顶。将胚胎放在带冰冷HSS溶液的培养皿中，并立即通过切割颈部区域将头部与身体分离。
然后将头部转移到新的培养皿与干净的冰冷HSS解决方案。一旦胚胎从卵子中去除，它就能产生导致细胞死亡的蛋白酶。因此，一旦胚胎在卵子外，尽快将头部与身体分离，以尽量减少细胞死亡，这一点很重要。
在冰冷的HSSS溶液中保持胚胎的头部也是非常重要的。将胚胎头举起来，将其固定在小鸡的嘴上，然后开始去除眼睛周围的薄层皮肤。小心地，轻轻将眼睛从头部旋转，将其取出。
当眼睛和小鸡的头部分离时，注意视神经被分隔开。眼睛与后侧向上，并注意到胆结，毗邻传感器视神经和胆状肌瘤。前结神经可能仍然附着在丝骨结节上，便于其识别。
从每只眼睛中解剖的丝骨结节，通过去除多余的组织来清洁它。将解剖的刚体转移到冰上带 HBSS 溶液的培养皿中。为了每毫升产生约 100 万个细胞，你应该解剖大约 70 个神经，并记住，获得的细胞群，也有非神经元细胞，因此为了减少非神经元细胞的数量，并增加你的中性细胞群的纯度，重要的是要很好地清洁。，去除所有多余的组织。
对于组织分离，您将需要，24井板，0.1%的三联溶液，不完整的丝状神经色介质，防火抛光玻璃巴氏移液器，和塑料巴氏移液器。预湿无菌塑料巴氏移液器，将所有硅粒收集到15ML管中，在200 G下离心2分钟。加入一毫升0.1%的三足水溶液，在水浴37度下孵育20分钟。
在200 G.下，立即离心两分钟，取出三元溶液，并加入一毫升不完整的介质。血清在不完全的介质中，会立即停止三辛的活性。在200 G下离心两分钟，并取出所有介质。
加入500个全介质微升，使用P1000微移子开始组织分离。开始上下移液，10至15次，然后，切换到火抛光玻璃巴氏移液器，再次，移液器上下10至15次。细胞悬浮液应变得模糊，作为成功组织分离的标志。
分离细胞所需的体积取决于在此获得的硅细胞数和颗粒大小。当上下移液以分离组织时，重要的是避免形成气泡，这将最大限度地减少细胞损失。重新悬浮细胞后，您可以将细胞悬浮液留在冰上直到电镀。
使用 neubauer 室中的 trypan 蓝色溶液确定细胞密度。该铅细胞悬浮在完整的介质中，具有5FTU，在所需的密度和板500微升的细胞每井。在37度和5%CO2下孵育细胞。
确保每天检查我们的培养，并跟踪细胞的发展。体外细胞发育得相当快，一天后，我们已经可以看到一些从细胞体延伸的中性。在体外7至8天后，神经元网络已经建立良好，细胞至少可以维持15天。
体外一天后，硅蛋白神经元表现出多极神话。然而，神经扩张在神经元中迅速发生，明显建立神经元网络，已经在24小时后。在体外，骨骼结节神经元负责眼睛肌肉的内侧。
因此，这些神经元培养，非常适合研究神经肌肉突触。为此，在肌肉细胞上可以镀上硅骨神经元。在这里，我们显示了一个成功的培养，眼睛玻璃，CG神经元，在眼睛V7小鸡皮细胞肌肉神经元的顶部。
突触囊泡标记，SV2，显示在CG神经元轴突和肌肉纤维之间建立的活性突触，很容易由多核识别。通过此协议获得的细胞结节神经元适用于免疫细胞化学、电生理学和生存论文等。这种解剖协议，产生非常低的神经元数量，但如果做正确，将提供纯群胆碱性神经元。
非常重要的是，每个小将都清洁得很好，多余的组织被切除。为此，应使用高质量的仪器，因此可以去除这种组织，以防止非神经元细胞的污染。胚胎的年龄将决定我们协议的成功。
理想情况下，应在 E7 和 E8 之间执行解剖。这个时间点是非常重要的，因为在这个阶段，正常发生在体外的发展细胞死亡还没有发生。为了尽量减少这些非神经元细胞的污染，我们在培养培养媒体中使用5FTU，以尽量减少胶质细胞和成纤维细胞的生长。这个细胞模型为研究你的神经性疾病提供了一个很好的替代方案。
基于此协议，可以解决额外的科学问题，例如，特定碳酸盐和特定蛋白质的亚细胞定位如何调节突触的形成和功能。此外，建立神经肌肉共培养物可以解决神经肌肉疾病研究等进一步的问题。
