我们感谢权限发布参考11日第130页上的最初出现的显微注射吸管制造图Humana压; Dlugas拉里和史蒂芬黄，OHSU的教育通信部，录像;拉里Dlugas为视频设计和编辑;亚当M.Ø “奎因，高级设计师，钛师傅/ Envirco公司提供的技术原理设计我们自定义的水平层流罩和Les高士指导维克多Monterroso，MV中，硕士，博士和汤姆Chatkupt的数字电压表，OHSU的比较医学部，与我们的动物保健协议，手术技巧，以及预防性镇痛方案;马塞尔·佩雷让蒂尔，数字电压表，硕士，兽医缝合技术分享他的讲义;爱德华Porsov，MS，设计我们的Adobe Premiere Pro中的视频显微镜的计算机工作站及利亚白乔纳斯LNS的欣克利字幕（波特兰，OR）。这项工作得到了耳聋和行吟从国家研究所的赠款R通讯障碍：以R01直流008595和008595-04S2直流以R01（山）和P30 DC005983（俄勒冈州听力研究中心核心格兰特，彼得·吉莱斯皮，首席研究员）。

1。腹剖腹<ol><li>麻醉的大坝，其胚胎在胚胎每天11.5（E11.5;阴道插件检测当天中午是胚胎发育0.5天），是由腹腔注射戊巴比妥钠麻醉剂溶液（每克体重7.5μL）。工作麻醉剂：50毫克/毫升巴比妥钠溶液180μL，100μL无水乙醇320μL65毫克/毫升的水硫酸镁（调节子宫张力）;丙二醇和400μL（车辆混溶与水和有机组件）。 </li><li>评估麻醉的完整性进行伤害性刺激试验：脸颊和触须触摸爪子挤压尾巴捏和眨眼回应。适用于无菌眼药膏的眼角膜。 </li><li>剃腹部的毛皮从耻骨上区的左肋用剪刀和罚款的刀片（奥斯特＃40刀片）。腹部用70％乙醇，10％的聚维酮碘（优碘），消毒ND 70％的乙醇，按顺序。广场上设置鼠标腹部面朝下，在无菌的悬垂性和加热垫或暖板为2-5分钟（37℃）。 </li><li>在腹侧中线与球头剪刀切开腹部皮肤。延长10-14毫米的切口。确定的白线 ，沿腹中线腹壁缺血，白色的结缔组织带。切开的白线与球放倒剪刀和延长切口10-14毫米。预热（37℃）乳酸林格氏液，立即灌溉腹部。 </li><li>没有植入网站上申请过大的压力，外部的双角子宫环钳。预热，乳酸林格氏液与灌溉外向的子宫角。 </li></ol> 2。 transuterine微量注射<ol><li>编造一个厚壁，具有以下特征的高硼硅玻璃毛细管内注射移液器：12-16μ米外径和20度斜角。 1萨特的P-97小方块长丝的吸管拔，使用下列程序：热量=斜坡测试加3个单位;压力= 200;拉= 0;速度= 46时间= 100）。与“萨特BV-10倒角，使用大口径移液器的104C（金）研磨盘。重悬表达质粒在3-4微克/μL无钙磷酸盐缓冲液（pH值7.2-7.4）。轻轻30秒快速绿色结晶浓缩DNA，涡，在10,000 g旋转10秒。经验的视觉跟踪注射的疗效快绿色的最低金额确定。回填与DNA /快速的绿色解决方案的斜面移液器。加载显微注射吸管连接高压注射器（Picospritzer使用&gt; 99％纯氮气源）移液器支架。 </li><li>透照与强度低，卤素灯可视化胚胎内的着床部位的子宫。确定了BEA婷的心脏，脑泡，肢芽，新生的后脑第 4脑室，和眼睛。冲洗子宫与预热，每2分钟，乳酸林格氏液维持水化。适用于对子宫的温和的压力，重新调整的胚胎，并确定上面提到的解剖标志。 </li><li>东方胚胎，以确定主头静脉，其前部和后部的分支侧面间质领土驻留在otocyst。不能看到otocyst适当的子宫透。 otocyst是位于主头静脉，沿静脉主干，形成美式橄榄球场的立柱或球门柱的形状的前部和后部的分支之间的中间。 otocyst是立柱之间的中间。 </li><li>注射针插入子宫在推定与该otocyst的位置轨迹通过。后通过影视小卡车，通过脉冲微量注射器一次我们想象的示踪染料和近似的枪头位置。推进千分尺控制下的吸管和脉冲再次评估的深度。进一步推进到外侧头间质和脉冲吸管反复。 ，成功otocyst定位将露出背部的淋巴管和扇贝前庭壳形状的锥形形状。释放压力，对子宫，取出胚胎/子宫移液器一项议案，并立即灌溉与子宫预热，乳酸林格氏液。 </li></ol> （三） 在体内电穿孔<ol><li>灌溉用乳酸林格氏液的子宫。新鲜应用乳酸林格氏液电情侣桨式电极的子宫是必要的。乳酸林格氏液的滋润钨电极表面。中心电极的路径注入otocyst。轻轻地压缩与电PA子宫ddles。阴极是在子宫壁的接触外侧注入otocyst和阳极接触子宫壁相邻的未注射otocyst的。与上electroporator的脚踏开关触发方波脉冲列车。电参数为：5，每脉冲43伏和950毫秒脉间延迟50毫秒脉冲。脉冲列车交付后，立即灌溉子宫。记录传递到组织目前的60-100毫安足够染耳上皮细胞祖细胞。注入和electroporate 4-6，E11.5胚胎每大坝。 </li><li>把这些胚胎的第 4脑室，其内耳执行第二个独立transuterine显微注射水溶液的荧光葡聚糖（的Alexa Fluor 488表达质粒表达质粒编码绿色荧光蛋白编码红色荧光蛋白或亚历克斯氟594）准确地注入至少60毫安的电流，每个脉冲是胆小的中电。荧光葡聚糖检测将是出生在后脑，使幼鼠的内耳胚胎发育过程中的操纵（见3.5）的选择。 </li><li>与乳酸林格氏液冲洗子宫角。重新插入腹腔的子宫角。预热，乳酸林格氏液2-4毫升冲洗子宫腔，并允许溢出切口部位排出到无菌的悬垂性。更换悬垂干燥，无菌材料。与非切割针和6-0可吸收缝线缝合腹壁。我们更喜欢运行的针，每针，锁定为腹壁和皮肤。 </li><li>干燥的水坝的毛皮和非甾体类消炎等作为美洛昔康皮下注射管理。返回大坝预热回收笼在无菌的悬垂性。监视和记录水坝的呼吸，切口部位的通畅，阴道血性分泌物。出血是RA重，但如果目前有增无减，安乐死的大坝，而她仍然是麻醉下。请注意她恢复意识，并尝试以走动的时间。返回的大坝鼠标殖民地时，她显示了进食和饮水的迹象，并已开始筑巢建立。通常情况下，这12小时内发生。 </li><li>出生时（出生后第0天），闪光的每个垃圾小狗的用GFP的得克萨斯州或红色滤镜1 stereofluorescence解剖显微镜检测荧光葡聚糖的后脑区域设置适当的。返回到哺乳期大坝只幼仔，显示后脑标签。 </li></ol> 4。代表结果<img src="/files/ftp_upload/3653/3653fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。电穿孔介导的基因转移到发展中国家的耳蜗。E11.5 otocyst注射表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和电脉冲（脉冲TRA参数：五，43/50毫秒脉冲和脉间延迟950毫秒）的电压脉冲。 A）从1产后第6天（六）小狗的otocyst注射和示范基地，通过耳蜗中间转EGFP的表达，在E11.5电穿孔的有代表性的内耳。从中间转和顶点只有耳蜗侧壁被删除。 E11.5祖上升到顶点的未转。二）与毛细胞标记（一）所有安装在耳蜗免疫，肌球蛋白7A（MYO7A），表明，EGFP的表达如下Corti器的轨迹，是非常本地化的头发感觉上皮细胞息。 C）从1 E18.5胚胎的otocyst在E11.5注射和电穿孔的有代表性的内耳。激光共聚焦投影演示在MYO7A的积极的感觉毛细胞EGFP的表达。 d）激光共聚焦投影耳蜗感觉上皮从E18.5科尔蒂器官表明绿色荧光蛋白expression的内毛细胞（IHC），外毛细胞（OHC），内（IPC）phalangial的细胞，支柱细胞（PC）和Deiters细胞（DC）。 （二）适用比例尺为（A）。

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	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear.">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).</li><li>Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+fate+in+the+sensory+epithelia+of+the+inner+ear.">Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear.</a> Nat. Rev. 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没有利益冲突的声明。

发展中国家小鼠内耳的基因转移到小鼠内耳耳基板的发展过程中的发展12,13植入后的第一周。由胚胎9.5天（E9.5），基板已内陷，并演变成一个充满液体的囊泡称为otocyst 2。在泡耳前兆引起成熟内耳内感官和nonsensory的细胞以及神经元支配的前庭和听觉的感觉上皮细胞的机械敏感的毛细胞。年底前胚胎阶段，复杂的，三 ​​维的膜迷路内耳形态成立3,12。通常增?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td>微消毒箱</td><td> ROBOZ </td><td> RS-9900a </td><td> 8X8.5X1.25英寸</td></tr><tr><td>球尖剪刀</td><td>罚款科学工具</td><td> 14109-09 </td><td></td></tr><tr><td>环钳</td><td>罚款科学工具</td><td> 11106-09 </td><td> 4.8毫米ID/6mm外径</td></tr><tr><td> adson组织钳</td><td>罚款科学工具</td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td>针驱动程序</td><td>罚款科学工具</td><td> 12502-12 </td><td></td></tr><tr><td>过敏注射器托盘</td><td>流式细胞Dickison </td><td> 305536 </td><td></td></tr><tr><td>缝合6-0 </td><td> Syneture </td><td> GL-889 </td><td> 0.7公吨胃肠缝合</td></tr><tr><td>乳酸林格氏注射液USP </td><td>巴克斯特</td><td> 2B2323 </td><td></td></tr><tr><td>快绿</td><td> Sigma Aldrich公司</td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td>硼硅玻璃毛细管</td><td>哈佛仪器</td><td> 30-0053 </td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠溶液</td><td> OVATION制药公司</td><td> NDC的67386-501-52 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO4.7H2O </td><td> Fisher Scientific则</td><td> M63-500 </td><td></td></tr><tr><td>丙二醇</td><td> Fisher Scientific则</td><td> P355-1 </td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td> Sigma Aldrich公司</td><td> E7023-500 </td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>勃林格Ingeheim </td><td> NADA的141-219 </td><td></td></tr><tr><td>微量普勒</td><td>萨特仪器</td><td>的P-97 </td><td> FB255B框灯丝咨询来自萨特文书的食谱移液器</td></tr><tr><td>微电极倒角</td><td>萨特仪器</td><td> BV-10 </td><td> 104C大型移液器斜边盘;咨询倒角理论的使用说明书</td></tr><tr><td>微量持有人</td><td>华纳仪器</td><td> MP-S15T </td><td>外径为1.5mm移液器和女性Picospritzer油管压力端口。 </td></tr><tr><td>镊子，风格电极</td><td>保得国际股份有限公司</td><td> CUY650P5 </td><td> 5毫米外径</td></tr><tr><td>方波Electroporator </td><td>保得国际股份有限公司</td><td> CUY21EDIT </td><td>脚踏板推荐</td></tr><tr><td> PICOSPRITZER三</td><td>派克汉尼汾</td><td> 051-0500-900 </td><td>脚踏板推荐</td></tr><tr><td>手动控制的微操作机器人</td><td>哈佛仪器</td><td> 640056 </td><td></td></tr><tr><td>水平层流洁净工作台</td><td> Envirco公司</td><td></td><td>低频630-10554自定义修改。见罩原理的补充资料。 </td></tr><tr><td>徕卡stereofluorescence解剖与Lumencor索拉光引擎microcope的</td><td> Bartels和Stout和Lumencor </td><td> MZ10F与Lumencor索拉光引擎</td><td>建议是footpedals，集中MZ10F触发索拉光引擎</td></tr><tr><td>的Alexa Fluor 594葡聚糖</td><td> Invitrogen公司</td><td> D22913 </td><td> 10mg/ml的，水</td></tr><tr><td>的Alexa Fluor 488葡聚糖</td><td> Invitrogen公司</td><td> D22910 </td><td> 10mg/ml的，水</td></tr><tr><td>环保，DRI </td><td>牧羊人专业子宫颈抹片ERS </td><td></td><td> <a href="http://www.ssponline.com" target="_blank">www.ssponline.com</a> </td></tr></tbody></table>

gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation

哺乳动物的内耳有6个不同的感觉上皮：3个半规管壶腹嵴，椭圆囊和球囊斑;科尔蒂在连续耳蜗器官。包含前庭毛细胞转导机械刺激到...有特殊意义的平衡，而在Corti器的听觉毛细胞是听觉1主传感器的嵴和斑疹。这些感觉上皮细胞的半规管和耳蜗形态的命运规范期间在小鼠妊娠的第二个星期的地方，主要是在出生前2,3完成。小鼠内耳发育研究的收获转基因胚胎在不同的胚胎或产后阶段，要进入细胞和/或4,5形态表型的分子基础的洞察力，要定期进行。我们推测这种基因转移到发展中国家鼠标在子宫内的内耳&lt;/ EM代表&gt;中的收益和亏损的功能研究方面免费的方法，以传统的鼠标转基因哺乳动物的内耳发育6背后的遗传机制的审讯。 这里展示的实验范式进行基因在小鼠内耳的错误表达研究解决分为三个一般步骤：1）腹开腹手术; 2）transuterine的显微注射; 3） 在体内电穿孔。腹的剖腹手术是老鼠生存的手术技术，允许子宫外化，获得实验获得的植入胚胎7。 transuterine显微注射法是利用斜面，玻璃毛细管微电极引入进入管腔耳泡或otocyst表达质粒在体内的电是方波，直接驶入祖细胞8-10表达质粒的电流脉冲应用。 11日的每一步，包括详细的笔记。小鼠实验胚胎学的技术可能难以学习的散文和静止图像单独。在目前的工作中，我们证明在基因转移过程中的3个步骤。最关键的是，我们部署数字视频显微镜，如何准确显示：1）确定胚胎在子宫内方向; 2）重新调整针对注射的otocyst，胚胎; 3）microinject示踪染料溶液到otocyst混合胚胎11.5天的DNA 12.5; 4）electroporate注入otocyst;和5）产后选择出生在标签电穿孔胚胎。我们提供有代表性的例子，成功转染内耳;图案指南otocyst误炸最常见的原因，讨论如何避免常见的方法错误;写在宫内 Ğ本准则烯转移动物保健协议。

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Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

在小鼠内耳是一个基板派生的感觉器官，在妊娠期间阐述其发展计划。我们定义一个<em&gt;在子宫内</em&gt;转基因技术包括三个步骤：鼠标腹剖腹，transuterine显微注射，<em&gt;在体内</em&gt;电。我们用数字视频显微镜演示实验胚胎学技术关键。

转基因小鼠内耳的发展<em&gt;在体内</em&gt;电穿孔

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

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Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

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