年龄、感染和耳毒性药物会导致内耳毛细胞退化，从而导致听力损失。在非哺乳动物脊椎动物中，如小鸡，毛细胞可以再生。这里描述的技术利用了在雏鸡胚胎上工作的成本效益，获得胚胎的便利性以及组织外植体的良好外显。
了解鸟类内耳毛的发育和再生可以为听力损失和潜在疗法提供重要的见解，外植体培养对于评估各种药物的耳毒性作用非常重要。在开始实验之前，采购新鲜产下的鸡蛋，并用70%乙醇清洁它们以防止污染。将种蛋在 37 至 38 摄氏度、湿度为 45% 的条件下孵化 3.5 至 4 天。
孵化后，通过将鸡蛋侧放五分钟，将胚胎重新定位到蛋黄的顶部。然后，用镊子在鸡蛋的顶部和钝端开一个小孔，让 21 号针穿过。使用5毫升注射器和21号针头，从鸡蛋钝端的孔中取出两毫升白蛋白。
用透明胶带覆盖钝端的孔。为了使鸡蛋窗口将透明胶带贴在蛋壳的顶部。使用垂直移液器拉拔器从标准玻璃毛细管中握住显微注射的针头。
拉动后，使用细镊子折断毛细管尖端，以获得约50微米的尖端直径和锥形末端。对于基因敲除实验，将三种构建体，即引导质粒，pcU6.1sgRNA，T2KeGFP，T2TP与1μg的SP Cas9蛋白，30%蔗糖和0.1%快速绿色染料以一比一的比例混合，最终体积为10微升。在电移多个质粒时，确保DNA的最终浓度至少为每微升4微克。
在弹簧弓剪刀的帮助下，在两厘米长和1.5厘米宽的窗户周围切开，露出胚胎。然后用镊子打开覆盖在胚胎上的绒毛膜，允许进入胚胎。注入约200纳升体积的DNA溶液混合物以填充耳囊泡。
为了确定引导RNA效率，请进行T7核酸内切酶测定。向胚胎中添加0.719%盐水滴剂以降低电阻，并防止过热。接下来，将正极穿过鸡蛋钝侧的孔，并操纵电极使其位于蛋黄下方。
将负极放在填充的耳囊上。要通过电穿孔将质粒转染到耳囊泡中，请使用方形脉冲发生器，并施加五个 25 伏脉冲，每个脉冲 100 毫秒，间隔 50 毫秒。根据单个电穿孔设置凭经验确定条件。
电穿孔后，通过添加几滴0.719%盐水来水合胚胎。用透明胶带重新密封鸡蛋，然后返回 37 至 38 摄氏度的加湿孵化器进行进一步孵化。使用70%乙醇和加热对手术台，显微镜载物台和周围区域进行消毒，或酒精对微解剖设备进行消毒，包括最小弹簧弓剪刀，微型刮匙和两对细钳。
准备解剖板，包括带有黑色硅胶底座的玻璃培养皿，90毫米塑料培养皿和60毫米培养皿。保持冷藏的PBS或汉克斯平衡盐溶液（也称为HBSS）准备好进行解剖。轻轻地将鸡蛋打入 90 毫米培养皿中。
然后识别雏鸡的外耳，并将头部转移到装有冰冷PBS的60毫米培养皿中。接下来，将喙的顶部朝内定向胚胎，并使用五号镊子之一握住喙。用第二个五号镊子挖出眼睛。
然后，从喙部到尾部，沿着头骨的中线切开，挖出大脑。添加更多冰冷的PBS或HBSS，并将拉根的两个耳石定位为耳蜗管末端的闪亮结构，靠近中线。为了隔离两个内耳，在两个拉根之间切开，并在该区域的上方和下方切开。
然后在倾斜的照明下可视化内耳的轮廓，并去除多余的组织和前庭。将分离的耳蜗转移到带有冰冷PBS的黑色硅胶底板上。使用五号镊子剥离软骨耳蜗囊以获得耳蜗管。
然后找到耳蜗管的起伏层或被盖，并使用55号镊子将其取出，露出基底或BP。接下来，去除盖膜以使用55号镊子暴细胞和支持细胞。对于基底的膜培养，取一个六孔组织培养板，每孔布置一个培养膜插入物。在200微升移液管中吸取一些培养基，然后用一个X HBSS缓冲液吸出解剖的基底外植体。
将外植体转移到膜上，并将其定向，使基底朝上，并且从顶部可以看到毛发和支持细胞。一旦外植体定位，从培养膜表面缓慢吸出HBSS缓冲液。在此过程中，外植体将附着在培养膜上。
通过在膜插入物和孔壁之间添加 1.2 毫升 dulbecco 的改良鹰培养基或 DMEM 培养基来填充六孔板的孔。为了制备耳蜗管的胶原蛋白培养物，将三滴新鲜制备的胶原蛋白混合物加入四孔板的每个孔中，并将解剖的耳蜗管转移到每个胶原蛋白滴中。将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育10分钟以固化胶原蛋白基质。
对于培养物的小分子处理，用补充有药理调节剂（如青霉素）的700微升培养基替换培养基，并如前所述孵育平板。每天更换50%的培养基。在适当的孵育时间后，取出培养基，并使用外植体进行下游测定。
在电穿孔设置中，正确的电极定位导致两个前庭器官在内耳中更高的GFP表达，以及确认转染的听基底。CRISPR Cas9介导内耳Atoh1基因敲除，导致毛细胞流失。Atoh1基因敲除通过卵电穿孔，然后孵育直到E10显示与空质粒对照相比，毛细胞发育减少。
虽然电穿孔是马赛克，但对照电穿孔细胞能够形成毛细胞。在Atoh1 gRNA电穿孔样品中，绿色荧光蛋白阳性细胞从未显示出毛细胞发育的标志物。基底在3D基质中的器官培养，例如胶原蛋白和带有毛细胞抗原抗体的染色剂，提供了长达五天的组织形态的出色保存。
在这些培养条件下维持毛细胞和支持细胞的组织。膜上的器官培养物可以维持长达五天，同时保持毛束的完整性。这可以在代表性图像中看到，通过尖端链接蛋白原钙粘蛋白15的定位。
为了研究毛束的发展，更高分辨率的成像，如超分辨率显微镜或扫描电子显微镜可以提供更多信息。在整个过程中应保持无菌条件。电泳时，确保胚胎不会变干。
滴定药理学抑制剂时，可以降低浓度以克服任何致死性。胚胎和外植体都可以用于成像实验。通过执行实时视频微观范围或静态光共聚焦电子显微镜，如协议所示。
鉴于使用小鸡内耳外植体的便利性和可及性，我们可以通过证明筛选使用培养基来鉴定毛细胞再生所必需的新分子。
