Name: optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
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我们感谢米奇杨博士进行编辑和评论，和Drs。雷渣嗯和鹏博寻求帮助。这项工作是由科学办公室，办公室的能源的美国能源部基础能源科学（合同编号DE-AC02-05CH11231），国家心脏，肺和美国国立卫生研究院的血液研究所（不支持。R01HL115153），以及美国国立卫生研究院的普通医学科学研究所（第R01GM104427）。

1，制备新鲜的负染色溶液在1％（重量/体积） <ol><li>把1毫克铀酸盐（UF）粉放入装有100毫升在黑暗的房间或箱子去离子水的玻璃瓶。 </li><li>搅拌溶液在o / n RT在一个黑暗的房间/盒。敷溶液瓶用铝箔以防止光射到溶液。 </li><li>过滤轻轻通过0.2微米（孔径）过滤器安装在一个5毫升注射器的解决方案。经过滤的溶液收集到几铝箔覆盖的Falcon管。该过滤器的注射器，还必须用铝箔包裹，以防止光的曝光。 </li><li>通过0.02微米（孔径）过滤器安装在1ml注射器，再次过滤溶液。将过滤后的溶液收集等分试样于2ml小瓶中。的注射器和小瓶覆盖有使用前的铝箔。 </li><li>立即冻结使用长柄钳浸入小瓶的分装成小瓶液态氮容器装满之后将溶液过滤。 </li><li>转移冷冻瓶到-80℃冷冻储存和将来使用。 </li></ol> 2，准备工作的负染色工作站和孵化工作站<ol><li>解冻的1％，用友液的小瓶中置水浴在室温。确保铝箔仍然围绕小瓶包装，以防止暴露在光线下。 </li><li>过滤该溶液后，它完全通过使用铝箔包裹的1ml注射器装用0.02微米的过滤器解冻。收集过滤后的溶液进入一个新的铝箔包装瓶，并把它放在里面盖覆冰盒等使用的冰。 </li><li>用手指推〜8英寸长的封口膜纸到一个空的蛋白质结晶板的表面使溶液板。它会产生行圆板的直径为〜5个毫米。使6板中的每一行的地方的封口膜板的扁平冰面冰里面含有呃盖，作为染色工作站。 </li><li>吸管〜35微升的去离子水到各左三个板的每一行中的，与吸管〜35微升过滤UF溶液上至右边三个板的每一行中。覆盖染色工作站有盖，以防止暴露在光线下的蛋白质染色前。 </li><li>制备EM网格孵育站通过填充一个空箱半用冰冷却，并附着旁边，可以安装在一个支承基座吊架。将样品镊子的衣架，其中镊子“提示是附近的冰面。半覆盖镊子的推介框唇高。一个理想的冰盒，使孵化站使用空枪头容器。 </li></ol> 3，操作OPNS <ol><li>辉光放电的碳薄膜涂层300目铜EM电网，持续10秒。 </li><li>拿起用镊子网格和通过保持网格以45°的倾斜和1英寸的冰以上钩镊子插入吊架表面孵化站内。 </li><li>稀释用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DBPS）的蛋白样品在最终蛋白质浓度〜0.01至〜0.005毫克/毫升。关于EM网格的碳侧的稀释后立即存款〜4微升稀释试样。 （DPBS可以改变为另一个缓冲器，如果蛋白是敏感的DPBS） </li><li>孵育的电磁网格孵化站内〜1分钟的样品。 </li><li>通过快速触摸用滤纸在网格边缘除去过量的溶液。 </li><li>快速触摸网格以纯水表面的第一滴（〜35微升）顶上的封口膜片上除去的EM网格的过量溶液后右。然后用滤纸迅速除去多余的水。 </li><li>通过洗涤EM网格上的封口膜剩余的两个水滴换两次重复步骤3.6（步骤3.6和3.7可以如果样品是水非常敏感被跳过）。 </li><li>漂浮在电磁GRIð立即对超滤溶液右边第一滴过量的水后，在EM网格的表面除去。然后孵育10秒。确保浮动网格用友的解决方案表面上之前3秒钟内完成水洗涤程序。洗涤时间较短的，更好的质量会。 </li><li> 3倍 - 通过渗透的提示到滤纸〜2清洁镊子。 </li><li>通过与滤纸接触网格边缘去除网格上的多余的溶液，然后浮栅上UF的第二压降。 </li><li>继续上面的第二个液滴一步3.10。 </li><li>浮于超滤溶液的第三液滴网格并覆盖染站为〜1分钟。 </li><li>可选步骤：在3.6中描述的水最快速洗网格。这个额外的步骤将有利于含过载免费金颗粒或染色背景样本。 </li><li>通过触摸该滤纸为th除去多余的溶液Ë整个背面网格（碳侧对面）。观察该溶液吸收到滤纸上后，右干下的氮气在室温下缓流的网格。 </li><li>放置在网格上的一张滤纸的培养皿内，并盖住盘部分与盖干燥室温下至少30分钟。对于一些样品，放置在网格中40℃培养箱中烘烤一个小时。 </li><li>存储网格为未来新兴市场研究的EM网格框。 </li></ol> 4，新兴市场检查<ol><li>之前正确EM检查网格上的小蛋白质的TEM对齐。 <ol><li>查询的最高可见吞环是一种无定形碳膜的功率谱来确定是否在TEM已经正确对齐的分辨率。由于TEM是由许多不同的用户共享，在TEM中往往不正确对齐。 </li><li>仔细检查试件的碳薄膜面积的功率谱来调整对准condition中的机器。最明显的吞环比有针对性的分辨率更好。 注：由于在120千伏高压线经营的六硼化镧灯丝的TEM正确对齐的例子，20多吞环可以可视化，其中，相应的分辨率可以比5.0更好的。这吞环是由下的〜1.6微米的散焦和20.4电子/ A2（ 图5）的剂量成像的非晶碳膜的傅立叶变换来实现。 注：高分辨率吞环的观察是必要条件，但不是充分条件适当调整。实际实现高清晰度的图像，许多其它参数也很重要，如样品的质量，辐射损伤，充电和漂流以及照射剂量率。 </li></ol></li><li>把散焦回近施科泽焦点成像小分子蛋白上的理想染区。 </li><li>搜索“阴天”区域IMAGê。一个理想的染色面积通常位于较厚的污渍区域，它看起来像在格栅上的“阴”区域，因为染色的厚度通常不均匀地分布在碳涂覆的栅格（ 图6）的边缘附近。通常，低倍率（&lt;100X）是帮助找到这些地区阴天第一放大成像之前。 </li></ol>

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相比于常规NS技术，OPNS可以防止红细胞钱串的工件（ 图1和9），从而提供可靠的和合理的高分辨率（〜1nm的）小蛋白质的结构细节（ 图2）。相比冷冻电镜，OPNS提供了一种高通量的方法，可检测多种蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用6。然而，OPNS仍然有它的缺点。相比传统的生理盐水，OPNS限嗣继承：i）如样品制备较复杂的步骤; ii）使用放射性物质，用友; ⅲ）保持染色新鲜由于由于其光灵敏度的UF染色的短效价; ⅳ），以防止沉淀超滤溶液必须储存在-80℃下，并且需要解冻使用前; V），最后所有的用友必须作为危险废物处理。相较于冷冻电镜，OPNS提供了相对较低的分辨率的图像，并不能保证任何尚未发现的神器在未来。 脂蛋白钱串形成的NS操作过程的影响 NS协议用 ​​于制备蛋白质的检查16,29-36,55可分为方法50三大类：混合55滴逐滴16和洗涤过 ​​程29。 ⅰ）该混合协议要求的染色和蛋白质样品中的特定比例的预混合，然后将混合溶液涂布到涂布在网格，最后除去空气干燥EM检查55之前用滤纸过量溶液碳膜。 ii）本降逐滴协议涉及应用（〜4微升）的样品直接下降到EM网格涂碳又让坐了约1分钟，然后应用染色的下降（〜4μL）之前，去除多余的样品溶液解决方案对电网的同一侧。孵化后约1分钟，取出exces氏染色，通过用干净的滤纸接触，最后递交空气干燥16,56-58。 ⅲ）洗涤协议（ 图7），要求样品溶液应用到一个EM网格涂布在碳，持续1分钟，然后每次用滤纸3,29,30除去过量溶液后立即用去离子水洗涤三次。 OPNS协议从该洗涤程序修改。 NS色斑类型和脂蛋白钱串形成的影响 在生理盐水中，由于重金属的污渍强电子散射提供了从蛋白质17-20,59对比度。 NS样品还可遭受更大的辐射剂量，并通过更清晰的阴性对照8,9,60增强蛋白质的功能。重金属的污渍可以被分类为：阴离子型，包括磷钨酸（PTA）16，甲胺钨14和硅钨酸61;和阳离子IC，如醋酸铀（UA）62，用友3,29,30和硝酸铀酰（联合国）63。一个是最常用的阴离子NS污渍是PTA 33,64-67。 PTA是杂多酸，其通常用于周围的pH 7.0 - 7.5。 PTA也可用于阳性染色3,16,68。 PTA的负电荷可以介导静电相互作用与不饱和脂质正电荷的头部基团，象POPC，既脂蛋白和脂质体的表面上。家长可以通过这种互动29,30甚至定期缓冲盐度29,30（ 图1）引起钱串形成。双氧铀的污渍，如UA，超滤和UN是用于阳离子重金属污渍和UA尤其常用于各种生物标本62,69,70的NS的替代选择。实验发现UF不会引起红细胞钱串，包含不饱和脂肪酸脂类，如POPC脂蛋白。然而，用友仍可能诱发鲁莱辅助形成于脂蛋白含有饱和脂肪酸的脂质，如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）和1 - 十六烷-2 - 十八酰基-SN-甘油基-3-磷酸胆碱（PSPC）。这种相互作用的详细机制尚不清楚。 UA / UF / UN都可以工作在较低的pH值范围为3.5至4.6。这种较低的pH值可能不适合于某些生物大分子是pH为14,71敏感。有趣的是，UA / UF可以通过未知机制72固定在几毫秒内蛋 ​​白结构。与PTA，UA /用友更类似于比酸的盐。 据报道，用友能提供更好的结果比UA 73，其中，用友和联合国污渍具有更小的晶粒尺寸比UA（UF：0.3纳米，联合国人：〜0.5 nm）的3.74。一个有趣的例子中，一个小的蛋白（53 kDa的CETP）的二级结构类似的信息可以从原始显微照片可以直接可视化时UF用作阴性染色试剂由以下的此前报道的冷冻阳性染色（冷冻PS）法（ 图8）6。在低温PS，染色的样品进行闪蒸通过以下在OPNS协议，并因此可能导致二级结构倒塌冷冻电镜样品制备过程，而不是干燥过程冻结。冷冻电PS是用于高对比度小蛋白75和高分辨率成像的方法。由于低温的PS图像互换了对比，相较于报告低温NS协议22，但具有一致的图像对比度对那些从传统的冷冻电镜图像，因此被命名为低温的PS方法。在低温的PS图像显示，染色试剂，铀酸盐，穿透分子表面，挑战传统的观点，即染色可以想像只有外表面结构。如何铀酸盐穿透分子表面的机制是未知的。一种可能性是，双氧铀阳离子结合可用的蛋白质的羧基，因而玻璃体冰周围是密度低于所述蛋白质和铀酰基的染色，从而可以用作阳性染色。冷冻电PS方法类似于多个同晶置换（MIR）方法，它是要解决在X射线晶体76-78的相位问题的常用方法。在MIR，水晶样品浸泡重原子的解决方案，其中包括铀，得到一个同构形式到它的原生形态。在加入重原子的有时不影响晶体形成或单元电池的尺寸而提供的晶体结构的测定76-78的附加 ​​信息。通过受益于小晶粒超滤，冷冻PS可以提供​​一个高对比度的单一蛋白，其用于蛋白质结构研究的重要，特别是当考虑到几乎所有的蛋白质都是自然动态和异构的溶液和高清晰度的图像。对于这种低温的PS方法的验证，我们打开从电磁场任何盲测。 </P&gt; 在钱串形成脂蛋白盐浓度的影响 使用传统的PTA负染试剂，观察到的钱串形成更多的可能与脂质的相互作用，而不是蛋白质相互作用。成像条件下相当的盐度（0.5M NaCl）中，中等盐度（0.25 M氯化钠），相对较弱的盐度（0.1M NaCl）中，并加入纯水（ 图9）制备的POPC脂质体囊的样品中，在电子显微照片显示了红细胞钱串的形成是相关的盐的浓度（ 图9A - D）。使用UF作为负染试剂，没有钱串中观察到POPC脂质体囊泡样品30（ 图2L），这表明该洗涤步骤可以快速降低盐浓度权利前染色是必要的，但为防止红细胞钱串中POPC相关不独立地足够步骤样品。 透射电子显微镜成像的小蛋白，需要近施科泽对焦状态。 小的蛋白质以更高的分辨率成功的TEM成像需要两个临界条件下，适当的光束对准和近施科泽焦点获取条件。 I）一个适当的光束对准可通过可视吞戒指（功率谱）根据相对较高的散焦收购碳膜图像的傅立叶变换的数量来判断。该光束的更好的对准状态下，更吞环可以被可视化和可测量..ⅱ）获取下一个近施科泽聚焦图像是另一个关键条件。传统的标准策略用于成像的生物样本通常利用高散焦（1 - 2微米，甚至更多），这可以提高生物样本图像的对比度79。这种策略是显著不同于典型的战略成像硬质材料原子分辨率的结构，这往往利用近施科泽对焦（〜50 nm的散焦）。虽然，有较高的离焦可以加强生物样品的对比度，高分辨率的信号将被部分地消除。其结果是，高清晰度信号的同谋就降低了在较高的离焦成像条件。其原因在于，该TEM像为样本结构的卷积和仪器的CTF。 CTF的是对频率，其中，所述曲线频繁振荡横过在高频零振幅的振荡曲线。每次当CTF跨零点，在这个特定频率的样品的结构的信号将被消除（零次任何数量将是零）。在这个频率的信号，消除了不能被任何周大福校正算法（一个零一个零划分可以是任何随机数，而不是原来的结构信号）进行回收。在较高的离焦成像，周大福将振荡更为积极，因此周大福过零幅度比较频繁，因此，在更多数量的特定频率的结构的信号将被淘汰。被淘汰越多的信号，更少的同谋的形象都会有。值得注意的是，图像的共谋无法恢复或由任何CTF校正进行了校正。然而，可以使用通过其平均的方法，其中甚至原子级的分辨率可达到9-12来填充其间隙彼此对样品的结构而得到的已完成的结构信号的一些在不同的离焦获得的未完成的图像。 的平均化方法是一种有效的方法来实现一些高度对称的蛋白质和结构上相关的硬质蛋白质的结构。然而，它仍然是在小型和非对称的蛋白质结构研究具有挑战性的，尤其是对于结构动力学和弹性蛋白，如抗体和HDL。平均值是基于这样的假设蛋白颗粒在结构和构象，但二相同fferent中取向，但许多蛋白质​​是已知的，以经受热力学涨落在溶液中。通过应用平均法而不事先知道蛋白质热力学涨落波动，平均结构往往会导致遗漏域10,80或81号决议的冷冻电镜重建局部变化。 在实现三维重建小蛋白的成功，如53 kDa的CETP和三维结构的单一蛋白质，如160 kDa的IgG1抗体，利用一个适当的取向状态下的近施科泽聚焦成像条件的好处。虽然图像的对比度似乎较低的近施科泽焦点的图像，对比度可以容易地通过简单地施加低通滤波处理，以减少在背景中高频噪声增强。我们相信，所述近施科泽聚焦图像进行最大结构的信号，并且可以增加粒子对准的精度和提高EFFI效率在单颗粒三维重构与单个颗粒的电子断层扫描重建。

了解蛋白质的功能需要的蛋白质结构的知识。结构决定是具有挑战性的蛋白质，其分子量都在40 - 200 kDa的。 X射线晶体结构是由蛋白质结晶的限制;核磁共振（NMR）光谱被限制为分子量小于40kDa的，而低温电子显微镜（冷冻电镜）具有难度都图像采集和小蛋白质的三维（3D）重建，其分子量是小于在超过200 kDa的。值得注意的是，超过50％的蛋白质具有40的范围内的分子量- 200 kDa的1,2，作为当前的方法在研究这种大小的蛋白质的挑战，需要一种新的方法。 虽然大多数透射电子显微镜（电信设备制造商）能够原子分辨率， 即比3的分辨率，从生物样品达到甚至接近纳米级分辨率的结构，而查林更改7。辐射损伤，对比度低，结构差，以及文物，如脱水一切阻碍高分辨率透射电子显微镜成像3,8。 在众多的TEM方法，冷冻电镜是实现接近生理条件下9-12高度对称大分子原子分辨率结构先进，尖端的方法。冷冻电镜样品制备闪光冷冻样品溶液，包埋在玻璃体冰，其随后被成像在低温下，如液态氮或氦的温度13的大分子。冷冻电镜的优点是样品出现没有文物和近自然结构8-12。冷冻电镜确实有它的缺点：一）需要安装或购买升级标准的瞬变电磁仪的冷冻电镜功能的附加设备。设备包括：防脏物，低温保持器，低剂量模式软件和低剂量森西略去的CCD摄像头，虽然这些设备的价格比电磁仪本身的价格要​​低得多;二）冷冻电镜操作需要较长的时间比NS操作。检查一个冷冻电镜样品往往需要较长的时间来准备样品，并操作该TEM仪器比NS的，因为冷冻电镜需要解决更多的困难，其中包括：液态氮温度下操作时，样品的充电，成像漂移，温度梯度，低剂量模型操作，样本的辐射敏感性和用量的限制。这些额外的步骤将放缓相比，NS数据采集获取有用数据的速度，虽然有少数冷冻电镜图像可以肯定会在1小时或更少的冷冻电镜专家编写的一个平衡的温度梯度仪获得的; ⅲ）用户需要额外的训练，诸如在成像进程内的处理液氮，冷冻冷冻电镜网格，低剂量的操作，剂量测量，处理充电，漂流和知识essing;四）缺乏可重复成像过程中不同的TEM会议一样冷冻标本。冷冻电镜样品很容易被冰污染样品装载和卸载到/从TEM仪器中受损。这种损伤是特别关注的问题，当样品是很难分离/纯化的14;由于低对比度v）的小蛋白质（&lt;200 kDa的分子量）是具有挑战性的将被成像; ⅵ）的低对比度冷冻电镜图像和高噪声减少的图像之间的互相关值，因此，在蛋白取向，构象和分类，测定减小整体精度特别是对于蛋白质在结构上是灵活的和自然波动在溶液4,5。 负染色（NS）是任何实验室，与任何类型的EM，可以利用研究蛋白质结构比较“古老”的历史方法。布伦纳和霍恩第一次提出了这个概念Ø˚F负染一个半世纪前的检查病毒15。 NS是通过涂覆具有带电重金属盐的样品来实现的。这个概念最初是从光镜和嵌入细菌进入染色液提供黑暗的标本周围，观看的负面形象16时，允许更高的图像对比度的做法到来。由于重金属离子具有以分散的电子相比密度较小的原子中的蛋白质17-20的更大的能力，和涂层重金属染色允许具有改进的对比度较高的剂量限制。 NS标本可以提供高对比度的图像，8粒子更容易定位的决心和三维重建比冷冻电镜图像。 传统的NS，不幸的是，可产生诱导染色-蛋白质相互作用，如一般聚合，分子离解，压扁和堆放8,21,22工件。对于血脂相关PROTE项，如脂蛋白16,23-30，一个共同的伪影的结果在粒子被堆叠和包装在一起成钱串（ 图1）31-36的。许多脂蛋白的研究，如非变性的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，冷冻电镜研究13,29,37-40，质谱39,41，和小角度X射线衍射数据42的所有节目脂蛋白颗粒是分离的颗粒，而不是自然堆积一起形成钱串21,29,30,35,42-45。的钱串形成常规生理盐水观察可能是脂蛋白载脂蛋白（APO）和磷脂的结构上灵活的解决方案，13,29,30,46-49和敏感性，以标准的NS协议的组成之间所造成的动态交互。要确定这件神器，载脂蛋白E4（apoE4的）棕榈oleoylphosphatidylcholine（POPC），高密度脂蛋白（HDL）的样品被用来作为测试样本，永冻EM图像神器免费29标准，筛选在一系列条件下制备的NS标本。通过比较从NS和冷冻电镜得到的粒子的尺寸和形状，染色用试剂和盐的浓度的特定类型被认为是使公知红细胞钱串现象的两个关键参数。因此，报道了优化负染色（OPNS）协议。 通过OPNS，apoE4的HDL的公知红细胞钱串现象由OPNS（ 图2A）被消除。统计分析表明OPNS产量的尺寸和形状非常相似的图像（少于5％的偏差）相比，那些从冷冻电镜，但是对比度被淘汰了。 OPNS的验证了通过检查消除几乎所有的类或脂蛋白的样品6,29,30,50,51，包括载脂蛋白A-I 7.8纳米（ 图2B），8.4纳米的子类中红细胞钱串工件的执行（ 图2C） ，9.6纳米ðiscoidal重组的HDL（rHDL）（ 图2D），9.3 nm的球形rHDL（ 图2E），人血浆中高密度脂蛋白（ 图2F），脂质自由载脂蛋白A-I（ 图2G），血浆高密度脂蛋白（ 图2H），低密度脂蛋白（LDL ）（ 图2I），中间密度脂蛋白（IDL）（ 图2J），极低密度脂蛋白（VLDL）（ 图2K），和POPC脂质体（ 图2L）30。 6，29，并且高度灵活的160 kDa的IgG抗体（ 图4A和B）的 4,5,29 -额外的验证是由成像小和非对称的蛋白质，其中包括53 kDa的胆固醇酯转移蛋白（CETP）（C图3A）进行，52，和两个结构以及已知蛋白，GroEL的蛋白酶体（ 图2M和N）。对于需要从C任何额外的验证olleagues，我们愿意在这个OPNS方法，任何盲目的测试。 OPNS作为一种高通量的协议也被用来通过检查数百小蛋白质的样品中，如CETP这是结合在一系列条件的各种蛋白质（包括CETP相互作用以4类脂蛋白的，重组的HDL研究蛋白质的机制，血浆中高密度脂蛋白，低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白，有/无2抗体，H300和N13，在9孵育时间，其中包括3分钟，20分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，24小时，48小时和72小时，根据4的摩尔比， 即 1：0.5，1:1，1:2，1:4和3的稀释液， 即，0.1毫克/毫升，0.01毫克/毫升和0.001毫克/毫升，加额外的对照样品，包括单CETP，独自低密度脂蛋白，极低密度脂蛋白和孤独，与不同的人上面的实验）6，29三重考验。 OPNS CETP的图像提供了高对比度的图像与合理精细结构细节;使我们能够成功地重建了53 kDa的SMA的3D密度图LL蛋白胆固醇酯转运蛋白（ 图3D - F）的单粒子重建。此外，高对比度OPNS图像为我们提供来自个体的蛋白质（ 图4A - C）的足够的信号，这使我们能够实现上述中分辨率（〜1.5 nm）的单一的（一个对象，没有平均）IgG抗体的三维结构通过个体颗粒的电子断层扫描（IPET）方法（ 图4E - J）5。 IPET的重建战略，方法，一步一步的过程和结构变异分析的详细说明以前报道4。电影讲IPET抗体重建程序，包括原始图像和中间结果，3D密度图和结构的对接也提供给公众通过上传到YouTube 5。来自不同个体抗体粒子的三维重建的比较可以揭示蛋白质动力学和c在化学反应中4,5 onformational变化。 考虑到蛋白质的50％以上具有分子量范围为40 - 200 kDa的1,2，在成像这些小蛋白的成功证明了OPNS方法是推常规EM边界朝着小和非对称结构的测定和机制的发现的有用工具。因此，详细的协议被提供如下。

<table><tbody><tr><td>Stain: Uranyl Formate</td><td>The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td><td>02545-AA</td><td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td></tr><tr><td>Syringe: 1 ml NORM-JECT</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td></tr><tr><td>Syringe filter: 0.2 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-487</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td></tr><tr><td>Syringe filter: 0.02 &amp;mu;m filter (Anotop 10)</td><td>Whatman</td><td>6809-1002</td><td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>D8537</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td><td>VWR</td><td>470152-246</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td></tr><tr><td>Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-300CN</td><td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td></tr><tr><td>Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>CF200-Cu</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td></tr><tr><td>Tweezer: Dumont Tweezer L5</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>72882-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td><td>EMD Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td></tr><tr><td>Filter Paper: Grade 1 circles</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td></td><td></td><td>Any type</td></tr><tr><td>Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&amp;micro;L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-520</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Glow Discharge Unit</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td></tr><tr><td>Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&amp;micro;L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-524</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td></tr><tr><td>Filter Tips: VWR Signature 200 &amp;micro;L Pipet Tips</td><td>VWR</td><td>37001-528</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F161201 and F167300</td><td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td></tr></tbody></table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

结构测定蛋白质是相当具有挑战性与40之间的相对分子​​质量的蛋白质 - 200 kDa的。考虑到半数以上的天然蛋白质有40之间的相对分子质量- 200 kDa的1,2，需要一个强大的和高通量的方法用纳米分辨能力。阴性染色（NS）的电子显微镜（EM）是一种简单，快速，定性方法已经经常被使用在研究实验室，研究蛋白质结构和蛋白质 - 蛋白质相互作用。不幸的是，传统的NS协议通常会产生对蛋白质结构的文物，尤其是脂蛋白的形成，通常呈钱串文物。通过使用从低温电子显微镜（冷冻电镜）作为标准脂蛋白的图像，在NS试样制备条件的关键参数最近被筛选和报告为优化NS协议（OPNS），修饰的常规NS协议3。像RO文物uleaux可以通过OPNS受到很大的限制，另外提供一起合理高分辨率高对比度（接近1）的纳米小和非对称的蛋白质的图像。这些高分辨率和高对比度的图像，甚至是有利的个体蛋白质（单个对象，没有平均）的3D重建，例如160kDa的抗体，通过电子断层4,5的方法。此外，OPNS可以是一种高通量工具来检查数百小的蛋白质样品。例如，53 kDa的胆固醇酯转移蛋白（CETP）的先前公布的机制涉及数百个样品6的筛选和成像。考虑到冷冻电镜很少成功形象的蛋白质少于200 kDa的仍未公布涉及筛选过百样本条件的研究，它是公平的调用OPNS高通量的方法研究小分子蛋白。希望这里介绍的OPNS协议可以是推E的边界的一个有用工具M和加快新兴市场的研究成小的蛋白质结构，动力学和机制。

OPNS的实施方式包括各种脂蛋白种类的结构和形态学检查，例如：新生重组的HDL（rHDL），球形重组高密度脂蛋白，血浆HDL，LDL，IDL和VLDL（图2）30;以及小分子蛋白，如53 kDa的CETP（通过EM成功地成像的最小蛋白质之间）（图3）6和物160kDa IgG抗体（最有活力的和异构的蛋白之一）（图4）4,5,29,52 ，甚至28 kDa的无脂 ​​质的载脂蛋白A-1（图2L），和的GroEL和蛋白酶体（图2M和N）。 OPNS作为一种高通量的方法，其他的例子是研究蛋白质相互作用为揭示该蛋白的机制，如53 kDa的CETP。正如引言中所述，如何与脂蛋白的不同的子类胆固醇酯转运蛋白相互作用是investiga泰德经检验超过400 EM标本6，据我们所知，有冷冻电镜研究，涉及筛选近百种不同条件下没有这样的情况。 OPNS可以扩大新兴市场的边界，研究小型和非对称的蛋白质三维结构，甚至扩大到实现3D结构，形成一个单一的和个人的蛋白质（不平均）。例如，IgG抗体是160kDa的分子具有高度灵活的结构，其中，所述三维重建在中间分辨率是具有挑战性的实现。在OPNS方法用于图像的个体的IgG抗体由一系列的倾斜角（图4E和H）的。在合理的高分辨率和高对比度的图像蛋白允许从由单个粒子的电子断层扫描（IPET）（图4E - J）成功重建的单一蛋白质OPNS 4,5。在IPET三维重建<suP&gt; 4，二维倾斜一系列有针对性的抗体逐渐通过随后迭代重建对准自己计算的全球中心，实现了3D密度为〜14.1的分辨率（图4F和G）4。通过同样的方法，单一抗体肽复合体重建，以及肽诱导的单一抗体粒子的内部结构域的构象变化，发现（图4I和J，分辨率〜16.6）4,5。比较不同个体粒子的三维重建，结构分析，可以使我们揭示蛋白质热力学波动，甚至是“快照”化学反应4,5,29,53,54的中间阶段。 综上所述，随着40 kDa的分子间质蛋白 - 200 kDa的都是标准的电磁结构检查和重建的挑战。考虑到50％以上的蛋白质具有的分子量范围为40 - 200 kDa的1,2，我们报告一个OPNS方法作为一种强大的和高通量工具推常规EM边界朝着小和非对称结构的确定，甚至机理研究。 <img alt="图1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" width="500" /> 图脂蛋白常规染色阴性（NS）的EM 1鲁洛神器 。电子显微照片（上图板）和选定的粒子（下面图）示出各种脂蛋白与NS用磷钨酸（PTA）根据标准混合过程后红细胞钱串：（A）再生高密度脂蛋白（rHDL）与载脂蛋白E4（B）载脂蛋白AⅠ-含有- 9.6纳米盘状rHDL，（三）含有血浆LDL（D）无载脂蛋白含POPC脂质体载脂蛋白B。酒吧：50纳米。窗口大小：A和C，20 N米; B，30纳米。脂类研究杂志最初发布此工作29,30。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a> <img alt="图2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" width="500" /> 图2：蛋白质结构被优化负染（OPNS）的EM电子显微照片显示出各种脂蛋白和脂质体没有钱串神器OPNS（一）老年apoE4含rHDL;（B）7.8纳米rHDL;（C）8.4纳米rHDL;（ D）9.6纳米rHDL（E）9.3纳米的球形rHDL;（F）的人血浆α-HDL（G）血浆HDL（高）人血浆低密度脂蛋白（一）人体血浆IDL;（J）人血浆脂蛋白; <stroNG&gt;（K）POPC脂质体（L），无脂载脂蛋白A-I。做用（M）的GroEL和（N）的蛋白酶体样品额外的验证。显微照片（上图）和选定的粒子（下面图）。酒吧：50纳米。窗口大小：A - D，20纳米; E和F，25纳米; G，20纳米; H，25纳米;我50纳米; J和K，100纳米; L时，80纳米。，除了脂质免费载脂蛋白A-I的GroEL和蛋白酶，这项研究最初发表于脂质研究29,30杂志。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a> <img alt="图3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" width="500" /> 图CETP的3 OPNS电子显微镜照片。 （一）概述显微与胆固醇酯转运蛋白（虚线圆圈）香蕉状颗粒（B）Windowed选择原料颗粒（C）三个单胆固醇酯转运蛋白原料粒子图像清楚地显示出更大，更重，更大的球形尖端包括其它更小，更轻和更窄的尖（左图），顶视图，显示较少的整体弧度相似的末端区域（中面板），和端视图下的CETP（右面板）的长轴（D）的叠加的晶体结构（PDB：2OBD）到这些原材料的CETP粒子的图像，在其结构形状和结构域的大小表示的取向可以是匹配良好几乎直接定义即使不通过计算机（相当于面板，以（C））的援助（E）参考的分类2D类的平均值（一从头过程来计算这些随机取向的颗粒的相似性（交叉相关计算），具有颗粒高的相似性，以彼此进行分组，对齐，然后平均，以减少背景噪声并增强了颗粒图像CON对比度。参考免费的2D类平均通过在电子舱单包refine2D.py软件计算，其中，没有参与这个类平均的任何人取得了初步的模型。参考类平均值可以作为一个独立的方法来验证三维重建从单粒子重建）（F）指定参考的分类2D类平均值显示出较大的前端相对于其它（G）的叠加的晶体结构（PDB ：2OBD）比较基准的平均自由，叠加图像显示在这两个结构的形状和大小域（低面板）的晶体结构和参考无类平均之间的近乎完美的比赛（F）的胆固醇酯转运蛋白的三维密度图。 13一项决议，从8879粒子OPNS和单粒子重建方法（上图）和脊体停靠到这个单粒子重建的晶体结构（小图）成像重建。该DET单粒子重建ailed信息，包括图像预处理，初始模型，细化程序​​，角分布和傅立叶壳牌相关（FSC）发表在方法部分和原来的纸（高）单粒子重建最终的比较（支持信息上面的图）和额外的PDB拟合比较（底部面板）6。条：一，50纳米;乙 - D，10纳米;楼3处。其中的一些数字先前公布的自然化学生物学6人。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a> <img alt="图4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" width="500" /> 图4 OPNS图像和人IgG 1抗体粒子重建。 （A）过鉴于人类IgG1抗体OPNS图像。中白圈所示的粒子显然与3子域的显示粒子（B）通过手动降低噪声周围原始粒子边缘（无触摸任何选定的五个单独的未缀合的抗体粒子和（C）其相应的降噪的图像的高分辨率的原始图像密度的颗粒内），以容易地可视化（D）的晶体IgG1抗体的结构（PDB条目1IGT），将其导向至一个同样观察到的EM图像。对应的图像的比较显示出的EM图像和晶体结构，包括结构域的位置和形状之间有许多共同的特征：（E）一种从头三维重建的单个实例IgG1抗体的步骤到步骤程序（没有平均使用单个颗粒的电子断层扫描（IPET）方法的一个单独的对象）（F）的Si的最终三维重建在1410的分辨率ngle抗体颗粒呈3甜甜圈形域在一个“Y”形形成。（G）对接域的晶体结构，为每个分别对应域密度图，并手动重复循环的领域之中。（H）三维重建的单一抗体肽复合物（不平均，一个人的对象）通过IPET的步骤对步骤的过程。（I）的抗体肽复合物的最终三维重建被显示在16.6的分辨率显示3条异型结构域在一个“Y”形形成（J）分别对对接各IgG抗体结构域的晶体结构（PDB条目：1IGT）。到每个棒状密度呈同域的晶体结构的匹配较差，这表明内结构域的构象变化之后肽结合。详细的过程，分辨率分析和统计的原始论文中描述<s达&gt; 5条：一，50纳米;乙 - D，10纳米。这部作品最初发表在PLoS ONE 4和科学报告5。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a> <img alt="图5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" width="500" /> 在1.6微米散焦由蔡司天秤座120六硼化镧透射电镜图5电源非晶碳薄膜的光谱成像，高分辨率成像要求有足够的证据显示，新兴市场有正确的定位和高分辨率的能力。附近的碳区域的网格上的功率谱的分析是一种有效的方法来检查光束相干性状态之前的数据采集。一种无定形碳区域的图像的傅立叶变换显示仪器相关的对比度传递函数（C<html> TF），所谓的吞环。一个适当的取向和一致性可以通过可见吞环的数量和可见吞环相对高的散焦状态下的最高分辨率来反映。 / A 2 -为一个的LaB 6灯丝配备的TEM邻近适当的对准条件，例如，超过约20吞环（〜5），可从碳薄膜可以产生使用剂量20.4 e被成像的在1.6微米的散焦。从低端的透射电子显微镜获得的吞戒指有一个类似于从高端透射电镜，如适当对齐条件下经营的场发射枪（FEG）增强透射电子显微镜。这部作品最初发表在科学报告5。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a> 6highres.jpg“WIDTH =”500“/&gt; 图的“理想”领域OPNS成像6例显微照片。三种蛋白样品中，（A）的GroEL（B）蛋白酶体（C）的球形高密度脂蛋白，被用来作为例子，说明理想的OPNS成像。由于污渍不均匀地分布在试样中，低倍率样品通常出现“混浊”（最左边的图）。成像的理想区域通常位于这些“云”的界限。的一个例子一步一步的变焦一体“阴天”染色区域（左中图）显示了高倍率图像和颗粒的高分辨率和高对比度的图像（右中图）呈递。粒子选择的图像显示蛋白质的结构细节（最右边的图）。酒吧：为30nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig6highres.jpg" target="_blank">，请点击这里查看大</a>ř版本的这个数字。 <img alt="图7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" width="500" /> 图7 OPNS过程的示意图。 （A）中的EM网格孵化站，简单站孵育在辉光放电网格的样品溶液（B）染色工作站，旨在保持水洗涤微滴，和上面的冰床染色液滴，同时最大限度地减少色斑暴露于光。 （C）的染色程序概述，表示：印迹方向，3倍的水漂洗3次超滤污点曝光，染色温育与染色液滴倒置样的网格，并最终背侧样品杂交，以保证在干燥前一薄层样品染色溶液通过氮气气。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看日的大</a>是图。 <img alt="图8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig8highres.jpg" width="500" /> 图8。高- 53kDa的小蛋白胆固醇酯转运蛋白的高分辨率图像显示，从修改后的OPNS法，冷冻阳性染色（低温PS）五个选择高分辨率和圆形胆固醇酯转运蛋白颗粒软屏蔽的RAW图像（使用反转对比）。和颗粒形状掩蔽原料颗粒（手动降低噪声周围原始粒子图像“的边缘，但没有在颗粒内的任何修改密度）容易地可视化。所有原子和带状晶体结构的比较，以掩蔽对准到每个粒子到EM图像的类似取向的原始粒子。原始图像区域的高分辨率细节显示某些相似性的晶体结构，而不是所有的晶体结构特征可以从原始数据来解决。 Remarka<html>布莱，这些原始图像表明两者的相似终端两端有附近的小圆孔出现在手动降低噪声的图像（三角形）;此外，粒子图像中，在C末端区域中的链互补晶体结构β-片（箭头），最后，对CETP的C末端区域突出循环是类似的晶体结构（菱形）（A）的五个选择胆固醇酯转运蛋白颗粒的高分辨率和圆形软屏蔽的RAW图像（使用反转对比），（B）低通滤波至10A（C）较高的低通滤波至20A（D）蒙面手动噪音降低影像（E）由带状结构，晶体结构的比较。所有原子表示（F）的晶体结构的比较。酒吧：5nm的。这项工作的一部分发表在自然-化学生物学6。平直“&gt;请点击这里查看该图的放大版本。 <img alt="图9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" width="500" /> 图9显示脂质体通过在不同的盐度传统的NS协议（PTA染色）ROULEAU形成的电子显微镜照片。 （一）高盐度（约0.5 MNaCl）（B）定期盐度（〜0.25 M氯化钠）（C）低矿化度（〜0.1 M氯化钠）（D）纯净水。显微照片（上图）和显示选择窗口颗粒（如下图）。酒吧：100纳米。窗口大小：80纳米。脂类研究杂志最初发布此工作30。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a>

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

以上蛋白质的一半是小分子蛋白（分子量&lt;200 kDa）的具有挑战，为电子显微镜成像和三维重建。优化的负染色是一个强大的和高通量的协议来获得高对比度和相对较高的分辨率（〜1毫微米）的小的非对称的蛋白质或复合物的不同生理条件下的图像。

优化负染：通过电子显微镜检查小和不对称蛋白结构的高通量协议

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

科研

生物化学

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

负染色的EM可视化蛋白质和大分子复合物：从电网的制备图像采集

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

生物工程

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of contrast enhancing stain reagent. Although limited in resolution to a maximum of ~18 - 20 &#197;, negative stain EM is useful for a variety of biological problems and also provides a rapid means of assessing samples for cryo-electron microscopy (cryo-EM). The negative stain workflow is straightforward method; the sample is adsorbed onto a substrate, then a stain is applied, blotted, and dried to produce a thin layer of electron dense stain in which the particles are embedded. Individual samples can, however, behave in markedly different ways under varying staining conditions. This has led to the development of a large variety of substrate preparation techniques, negative staining reagents, and grid washing and blotting techniques. Determining the most appropriate technique for each individual sample must be done on a case-by-case basis and a microscopist must have access to a variety of different techniques to achieve the highest-quality negative stain results. Detailed protocols for two different substrate preparation methods and three different blotting techniques are provided, and an example of a sample that shows markedly different results depending on the method used is shown. In addition, the preparation of some common negative staining reagents, and two novel Lanthanide-based stains, is described with discussion regarding the use of each.

Negative stain EM is a powerful technique for visualizing macromolecular structure, but different staining techniques can produce varying results in a sample dependent manner. Here several negative staining approaches are described in detail to provide an initial workflow for tackling the visualization of challenging systems.

负染色电子显微镜方法的变化: 处理具有挑战性的系统的工具

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

单粒子冷冻电子显微镜在结构中测定脂质敏感分通道 trpc3 的表达与纯化

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The overall process involves i) vitrifying the specimen in a thin film supported on a cryoEM grid; ii) screening the specimen to assess particle distribution and ice quality; iii) if the grid is suitable, collecting a single particle dataset for analysis; and iv) image processing to yield an EM density map. In this protocol, an overview for each of these steps is provided, with a focus on the variables which a user can modify during the workflow and the troubleshooting of common issues. With remote microscope operation becoming standard in many facilities, variations on imaging protocols to assist users in efficient operation and imaging when physical access to the microscope is limited will be described.

Structure determination of macromolecular complexes using cryoEM has become routine for certain classes of proteins and complexes. Here, this pipeline is summarized (sample preparation, screening, data acquisition and processing) and readers are directed towards further detailed resources and variables that may be altered in the case of more challenging specimens.

单颗粒冷冻电子显微镜:从样品到结构

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

单粒子电子显微镜外切体综合重建，使用随机的锥形倾斜方法

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

生物学

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

优化低温电子显微镜的样品制备

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

纳米有限元分析：蛋白质定位的光激活定位显微镜和电子显微镜

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透射电镜的小型化样品制备方法

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

超结构保存细胞内膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...