作者感谢 Biozentrum 大学巴塞尔分校为他们提供的支持, 为关键的讨论和仔细阅读手稿, 费克图-LeFebvre 技术援助与 EM, 里卡多 Adaixo, 弗兰克莱曼为膜蛋白测试样本 (所有来自中国, Biozentrum, 巴塞尔大学) 和恩格尔, 名誉大学巴塞尔为他鼓舞人心的谈话。测试样品由 p. Ringler 提供。鳅和 t. Schwede (Biozentrum, 巴塞尔大学), p 雷曼 (结构生物学和生物物理学实验室, EPFL) 和 r. 迪亚兹-塞缪尔阿瓦洛斯 (纽约结构生物学中心, 美国)。该项目得到瑞士纳米研究所 (SNI、项目 P1401、阿尔高项目 MiPIS) 和瑞士国家科学基金会 (SNF、项目 200021_162521) 的支持。

一个 "cryoWriter" (图 2; 有关详细信息, 请参见以前的工作24、26、27) 或以下协议所需的等效检测。在材料表中给出了主要部件和消耗品的供应商名单。
1. 负染色 (NS) 网格准备
<ol><li>打开仪器, 启动软件。初始化所有必要的模块 (注射器泵控制器, 机动阶段, 监控摄像头, 露点阶段)。</li>
	<li>冷却样品支持和露点阶段。如果需要, 请确保露点级温度在露点以上 1-2 摄氏度上调节。 注: 该舞台由一个带有 PID 控制器的商用珀尔装置冷却。</li>
	<li>通过填充100或200µL PCR 管与 100-150 µL 的 ns (例如, 商业上可用的2% 甲胺钨酸盐), 制备 ns。把管子放在仪器的冷却样品支撑上。</li>
	<li>定位样品。<ol>
<li>将样品 (0.5-1 µM) 放入100或200µL PCR 管中。如果有少于50µL 的样品可用, 切下的 PCR 管底部与刀片和使用它作为一个样本好。这将确保 microcapillary 可以很容易地到达样品。 注: 从100或200µL PCR 管中抽取样品是最容易的, 因为以后用于吸吸样品的 microcapillary 略有倾斜, 而行程高度 z 轴方向是有限的。</li>
		<li>将 PCR 管/容器放在仪器的冷却样品支架上, 以防止蒸发。或者, 在室温下, 在显微镜阶段顶部孵化器中, 样品可以从井板吸气;没有为井板实现冷却。</li>
	</ol></li>
	<li>定义位置。使用 cryoWriter 操纵杆, 用于控制线性 x、y 和 z 轴阶段的机动 xy 级和软件控制按钮, 以定位 microcapillary。使用相机检查毛细管的位置。<ol>
<li>将 microcapillary 移动到样品库。将尖端浸入样品液中, 并将此位置保存为 "样品"。</li>
		<li>将 microcapillary 移动到 ns PCR 管, 将尖端浸入 ns 溶液中, 并将此位置保存为 "污点"。</li>
		<li>将 microcapillary 大约100µm 放在插槽的中心位置上, 并将此位置保存为 "grid_save"。</li>
	</ol></li>
	<li>抽取样品并将其条件用于 NS EM。<ol>
<li>如果尚未安装, 在精密注射器泵上安装10µL 注射器 (0.46 毫米内径)。</li>
		<li>将30厘米长的熔融二氧化硅 microcapillary (外径360µm, 内径150µm) 的一端粘附到注射器插座上。</li>
		<li>将 microcapillary 的另一端连接至短 (5 厘米) 长锥形 microcapillary, 通过压合接头。短 microcapillary 的锥形尖端形成配药尖端。</li>
		<li>用脱气双蒸馏水 (ddH2O; 系统液) 填充注射器, 避免气泡的形成。</li>
		<li>释放一些 nanoliters 的系统液, 从 microcapillary 中取出任何不起毛的水滴。</li>
		<li>双击保存的示例位置。这个位置的 microcapillary 在样品井。当毛细管移动时, 在 microcapillary 尖端浸入样品之前, 分配 3 x 0.5 nL 的系统液体, 以防止气泡被困在那里 (见下面的注 2)。</li>
		<li>吸入5的样品。</li>
		<li>双击保存的 NS 位置。microcapillary 从样品容器中提取, 并自动移动到 NS 水库。当毛细管移动时, 在尖端浸入储层之前, 手动分配 3 x 0.5 的样品液体, 以确保没有气泡 (见下面的注 2)。 注:重要提示: (1) 当从抽吸方式切换到配药模式或反之亦然时, 由于注射器泵齿轮的反弹, 活塞行程有很小的损失。根据制造商的数据, 一个新单位的反弹在7到12µm 之间。对于我们的注射器与桶直径0.46 毫米, 这转换为 1-2 nL。因此, 1-2 nL 可以被 "免除", 在样品实际上被免除之前。通常, 一个微小的水滴开始退出 microcapillary 尖端后, 第三个0.5 的 nL 分配步骤。(2) 被困在样品上方/下面的气泡会使分配不太准确, 并防止通过扩散来进行样品调理。</li>
		<li>将 microcapillary 浸入3-12 分钟, 具体取决于样本缓冲区和喷嘴几何。 注: 在缓冲液中盐和/或磷酸盐浓度越高, 所需浸泡时间越长。NS (相对较快) 扩散到样品插头, 而缓冲盐 (相对较快) 和蛋白质 (慢得多) 弥漫出来。这降低了样品中的缓冲盐浓度, 防止在加载的网格干燥时结晶。此外, 磷酸盐往往形成沉淀与 NS 结合。</li>
	</ol></li>
	<li>准备一个网格并存放条件样品的位置。<ol>
<li>当样品被限制时, 取一条胶带和一根硅橡胶块, 并通过应用和去除胶带来清洁其顶端, 以确保没有灰尘。在培养皿中放上一块。 注: 新的聚硅烷块是从洁净室中取出的。</li>
		<li>小心地拾起一个网格 (例如, 铜, 200 或400网格涂上 Parlodion/C 胶片)。请务必用镊子触摸网格的边缘。将其放在干净的基片上, 碳膜朝上。</li>
		<li>放在一个空气辉光放电单元和辉光放电在二十年代与 100 W 功率在0.4 毫巴的网格。将网格存储在封闭的培养皿中。更长的辉光放电时间通常导致在网格上堆积的样品容量的更大的传播。因此, 染色层变得更薄 (更弱的污渍)。</li>
		<li>浸泡时间1分钟前, 用 cryoWriter 镊子抓住辉光放电栅格。确保电磁铁开启;否则在软件中打开它。在电磁铁上安装镊子, 使用手动机器人螺钉将网格平放在露点台上, 碳膜侧向上。确保露点级温度在露点以上调节1-2 摄氏度, 以降低试样加载后的蒸发速率。</li>
		<li>当浸泡时间到了, 双击 "grid_save"。microcapillary 提示将安全地放在网格表面的上方。手动使 microcapillary 尖端与网格接触。将喷嘴提升10µm, 并将其放置在中心上方。 警告:一些含有洗涤剂的样品在液体由于表面张力较低时, 会沿 microcapillary 的外表面向上移动。很重要的是要非常接近网格表面, 以防止这种损失。</li>
		<li>在网格上分配5个样本。在干燥的一天, 当快速蒸发发生在 microcapillary 的尖端, 你也可以慢慢地免除, 直到样品在非常尖端, 然后迅速分配 5 nL。</li>
		<li>提取 microcapillary, 让条件样品在露点阶段缓慢干燥 (DP 阶段)。</li>
		<li>一旦样品点干了, 取出网格并将其储存在室温下的网格盒或培养皿中。</li>
		<li>从 microcapillary 中释放出500的系统液体, 用无起毛的纸巾将其取出。用乙醇、洗涤剂或1米氢氧化钠冲洗毛细管5次。这将清除 microcapillary 允许它与不同的样本一起使用。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 低温网格准备
<ol><li>要准备仪器和样品, 请按照上文所述步骤1.1 至1.5。如果不需要 NS, 请省略步骤1.3 和1.5.2。为了交换样品缓冲或条件的样品为冷冻 EM 通过透析,例如, 为了减少缓冲盐的浓度或引入添加剂 (如海藻糖, 洗涤剂) 使用所需的缓冲区, 而不是 NS 在步骤1.3 和1.5.2。</li>
	<li>在标准的低温容器中制备液态乙烷。<ol>
<li>将乙烷杯、冷冻箱架和蜘蛛组装起来, 用液氮填充制冷剂容器;通常需要大约200毫升。等待几分钟, 直到乙烷杯冷却下来, 并没有液氮。</li>
		<li>打开乙烷气瓶, 慢慢让气流进入乙烷杯。让它充满液乙烷, 直到水平是2-3 毫米以下的顶部;这需要几分钟, 需要大约5毫升的液态乙烷。</li>
		<li>取一个冷冻箱, 放在制冷剂容器的一个自由插槽中。</li>
		<li>取下蜘蛛, 把 polystyrol 盖子放在上面, 把制冷剂容器放在 cryoWriter 的安装上。</li>
	</ol>
</li>
	<li>辉光放电 EM 网格。<ol>
<li>取一条胶带和一个烷 () 块, 并通过应用和去除胶带 (除去任何灰尘) 来清洁顶面。在培养皿中放上一块。</li>
		<li>小心地从网格框中选取一个网格。请务必用镊子触摸网格的边缘。把它放在一个干净的孔碳膜朝上。</li>
		<li>在等离子清洗器和等离子清洗网格表面 (例如, 使用 75% Ar/25%h2,功率 50 W, 压力 25 mTorr) 将该基板与网格放在一起。在培养皿中, 将其与辉光放电的网格放在一起。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在仪器中定位网格<ol>
<li>用 cryoWriter 镊子抓住辉光放电网格。确保电磁铁开启;否则在软件中打开它。在电磁铁上安装镊子, 使用手动机器人螺钉将网格平放在舞台上, 碳膜侧上。</li>
		<li>双击 "grid_save"。调整 microcapillary 位置, 使笔尖在网格表面上方约10µm。确保 microcapillary 可以自由移动横跨网格, 而不触及它的任何地方, 如果需要撤回 microcapillary 几微米。</li>
		<li>返回到网格的中心, 并将新位置保存为 "网格"。 警告:必须正确命名宏脚本才能正常工作。</li>
	</ol>
</li>
	<li>编写示例和冻结网格。<ol>
<li>用几 nanoliters 的系统液冲洗 microcapillary, 从 microcapillary 中取出任何不起毛的水滴。</li>
		<li>启动宏脚本。宏将执行以下步骤:<ol>
<li>分配 5 nL (消除任何气泡在尖端), 并前往样品位置。</li>
			<li>吸入65的样品。注入 5 nL 回到样品管。这说明了系统的反弹, 并允许同步写入, 以确保分配和阶段的移动在同一时间开始。</li>
			<li>移动到 "网格" 位置。</li>
			<li>启动 ' 写作模式 ', 这将导致 microcapillary 移动横跨网格, 同时分配 45 nL 样品。</li>
			<li>然后, 将 microcapillary 移回网格中心, 再将其降低10µm, 并提取多余的样品液。</li>
			<li>撤回 microcapillary 并关闭电磁铁。这释放镊子和启动冻结。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>抓住镊子, 小心地从柱塞上松开磁适配器。快速将栅格从乙烷杯转移到包含冷冻箱的制冷剂容器中, 并将网格放在一个自由插槽中。</li>
</ol>3. 单细胞裂解制剂
<ol><li>准备电穿孔的 microcapillaries。 注: 锥形 (激光拉和检查) 熔融二氧化硅 microcapillaries 有一个保护聚酰亚胺涂层的外部, 除了尖端, 其中涂层在逐渐变细的过程中被烧毁。<ol>
<li>要将 microcapillaries 涂上导电层, 请将其安装在金属导轨上的45°角上, 并指向向上的提示。使用铝箔来保护小贴士的下端 (2 厘米), 因为未涂覆的聚酰亚胺形成了最好的密封, 用的是以后使用的压接连接器。</li>
		<li>溅射沉积20纳米钛/瓦的粘性层, 然后200纳米厚的 Pt 层。</li>
	</ol></li>
	<li>使 microcapillary 尖疏水。<ol>
<li>在乙醇中准备一个1米的 1 dodecanethiol 溶液。</li>
		<li>辉光放电的 microcapillary 在空气中为1分钟, 100 W 功率在0.4 毫巴。</li>
		<li>将 microcapillary 的尖端浸入 1-dodecanethiol 的1米溶液中数小时 (理想情况下过夜)。 注意: 最好在使用前一天新鲜地准备好提示。</li>
	</ol></li>
	<li>安装新的 microcapillary。<ol>
<li>从 1-dodecanethiol 溶液中取出 microcapillary, 用乙醇冲洗外部, 用注射器冲洗里面的乙醇。 注: 如果没有功能性 microcapillaries 可用, 快速辉光放电的 microcapillary 的尖端, 并蘸在一滴商用汽车窗口处理, 这是一个混合的聚丙烯酸和硫酸。由此产生的疏水功能功能不如 1-dodecanethiol, 但一般是足够的。</li>
		<li>用毛细管切割器将其未涂布的端。 注意: 一个干净的切割是很重要的一个良好的密封与压合连接器。</li>
		<li>当聚酰亚胺涂层在毛细管拉拔过程中被激光烧毁时, 使用牙签将银膏应用于玻璃与聚酰亚胺涂层之间形成的尖锐的边界。 注: 这一加固是必要的, 因为 Pt 涂层是非常薄弱, 在这个地区, 和导电可以很容易地打破。</li>
		<li>用丙酮洗涤 microcapillary 的聚酰亚胺末端。在最后留下一小滴丙酮, 并将其插入到压合接头的孔中。施加轻压力, 形成良好的密封。</li>
	</ol></li>
	<li>校准 microcapillary 位置。<ol>
<li>打开仪器, 按照步骤1.1 中的说明启动软件。此外, 还要初始化显微镜摄像机和函数发生器。</li>
		<li>将玻璃显微镜滑入显微镜上的滑动架上。</li>
		<li>将 microcapillary 靠近玻璃滑块, 并将其中心在显微镜的目标上, 直到它出现在显微镜照相机视图中。使用 x 和 y 轴线性阶段将 microcapillary 的尖端定位在图像的中心。然后慢慢地降低小费, 直到它略微触及玻璃幻灯片。 警告:选择非常小的步骤 (5 µm) 朝向最后的方法。否则, 提示可能会损坏。</li>
		<li>按 "校准喷嘴" 按钮。这缩回 microcapillary 40 毫米, 并且设置这个位置作为家位置。</li>
	</ol></li>
	<li>冲压件和 ITO 滑板的制备<ol>
<li>混合在10:1 的比例, 并倒入一个大的培养皿到一个深度约2-3 毫米. 在一个杂交孵化器或类似的设备上烘烤几个小时。</li>
		<li>用锤子和邮票 (直径12毫米), 在该层上切孔。之后, 使用手术刀切割出2厘米长的方块或长方形, 包括孔, 以获得冲压件, 适合于显微镜幻灯片。通常, 两个冲压件安装在一个显微镜幻灯片。</li>
		<li>先用洗涤剂, 然后用70% 乙醇清洗该片和 ITO 幻灯片。把它们放在一个培养皿里, 然后让乙醇在一个烤箱里完全蒸发。</li>
		<li>辉光放电的 ITO 幻灯片1分钟, 100 W 的力量在0.4 毫巴, 然后应用1毫升的涂层溶液 (如, 聚 l-赖氨酸)。孵育5分钟, 用吸管去除溶液, 并应用1毫升的 ddH2o 微搅动1分钟, 然后用吸管去除 ddH2O。让幻灯片干燥在。</li>
	</ol></li>
	<li>准备细胞培养。遵循标准的黏附细胞培养协议 (例如, 阿诺德,等等。24,25). 在正常分裂/传代过程中 ITO 上的种子细胞。<ol>
<li>带一个新的 PLL 涂层 ITO 幻灯片, 并添加一条。施加一些压力, 形成一个防水密封。这将生产小井以幻灯片作为他们的基地。</li>
		<li>增加约300µL 的细胞悬浮在新鲜的培养基, 以新的。播种密度应该是大约7.5万细胞每井。</li>
		<li>在标准条件下孵化1-2 天的 ITO 滑梯。</li>
	</ol></li>
	<li>细胞裂解实验的准备:<ol>
<li>预热几毫升的电穿孔缓冲液 (如磷酸盐缓冲盐水 (PBS))。</li>
		<li>准备建立 NS EM 网格准备 注意: 准备设置的详细信息显示在步骤 1.1-1.5 (NS) 或步骤 2.1-2.4 (对于低温) 中。在这里, 我们描述了 NS 准备的最重要步骤。<ol>
<li>用100-150 µL 的 ns (例如, 商用的2% 甲胺钨酸盐) 填充100或200µL PCR 管, 制备 ns。把管子放在仪器的冷却样品支撑上。</li>
			<li>将 microcapillary 移动到 ns PCR 管, 将尖端浸入 ns 溶液中, 并将此位置保存为 "污点"。</li>
		</ol>
</li>
		<li>加载标准的裂解参数,例如裂解电压。</li>
		<li>从孵化器的 ITO 幻灯片, 并将其安装在显微镜插入。使用两个螺钉固定在铝插入板上的幻灯片, 并确保在 ITO 涂层的幻灯片和电子接地铝框架之间的电接触。</li>
		<li>取出细胞培养培养基, 用300µL 电穿孔缓冲液清洗两次。把细胞放在电穿孔缓冲器里。</li>
		<li>在安装过程中, 将铝插入物置于活细胞孵化器阶段的 ITO 滑动。</li>
		<li>在显微镜视图中找到单元格区域性, 然后选择没有单元格的区域。接近针尖到 ITO 表面, 轻轻地触摸它, 然后撤回提示100µm 和保存的位置为 "细胞"。</li>
		<li>迅速离开细胞培养和冲洗 microcapillary 尖端与一些 nanoliters 的系统液体, 然后再次投入细胞培养。在浸入到 nanoliters 的过程中, 要确保没有气泡被困在尖端。</li>
		<li>轻轻接近 ITO 表面 (最初, 你必须在位置 "细胞", i. e, 100 µm 在表面之上)。接触后, 退刀提示10µm。</li>
		<li>选择附近的细胞进行裂解。将 microcapillary 的尖端放在目标单元格的上方。</li>
	</ol></li>
	<li>启动用于单细胞裂解的宏脚本。<ol>
<li>在成功裂解单元格后, 命名 microcapillary 应移动到的位置。这将是 ns 水库 (ns), 一个脱盐缓冲 (冷冻 em) 或 em 网格 (冷冻 em)。避免拼写错误并按 "确定"。</li>
		<li>宏在没有用户干预的情况下进行:<ol>
<li>i) 显微镜阶段和细胞培养100µm 向左移动, 拍摄目标细胞的快照, 50 ddH2O 系统液体从 microcapillary 中排出。这会取代和稀释高盐缓冲, 并将渗透压力应用于细胞。</li>
			<li>二) 舞台被移回, 将尖端定位在目标细胞上方。预先设定的电压爆裂, 并在500毫秒后, 泵系统开始吸入 3 nL 的样品, 流速为2µL/分钟。</li>
			<li>iii) 舞台再次向左移动, 允许检查细胞。出现一个窗口, 要求用户输入。</li>
		</ol>
</li>
		<li>说出裂解步骤是否成功。<ol>
<li>如果答案是 "否", 请接管, 冲洗 microcapillary 并瞄准一个新的单元格。</li>
			<li>如果答案为 yes, 则将删除 (裂解) 单元格的快照, 然后将 microcapillary 移动到3.8.1 中指定的位置。如果这是 NS 或缓冲水库, 使用标准用户界面分配 3 x 0.5 的液体, 而 microcapillary 正在移动, 以确保没有气泡。尖端被宏观浸入油藏液体中。 注意: 您可以继续条件样品和准备网格, 如第 1.6.9 1.7.9 部分所解释的, 即 2.2-2.6 段用于冷冻 em。下面说明了 NS 网格准备的必要步骤。</li>
		</ol>
</li>
		<li>将 microcapillary 浸入8-12 分钟, 具体取决于喷嘴的几何形状。 注: 高磷酸盐浓度在缓冲需要更长的浸泡时间的调节。</li>
		<li>在网格上分配5的条件细胞裂解液。</li>
		<li>提取 microcapillary, 让条件样品在露点阶段 (DP 阶段) 缓慢干燥, 在露点温度以上调节1度。</li>
		<li>删除网格并将其存储在室温下的网格盒或培养皿中。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+&#181;-fluidics+to+electron+microscopy.">Connecting &#181;-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy.">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li><li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy.">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li><li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., M&#252;ller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBEB:+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements.">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).</li><li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+interactome:+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy.">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li></ol>

作者斯蒂芬 a. 阿诺德, Stahlberg 和托马斯. 布朗宣布了以下相互竞争的财政利益: cryoWriter 概念是专利申请的一部分 PCT/EP2015/065398 和 EP16194230。

提出了从 nL 大小的总样本量中制备 NS 和冷冻 EM 样品网格所需的 "cryoWriter" 仪器和协议, 并完全避免了经典的纸印迹步骤。微流控原理和机械系统结合在 cryoWriter 中, 使之成为可能。
我们的经验表明, 当使用本手稿中提出的小型化方法时, EM 网格准备的参数空间比经典方法大, 并且在用户控制更严格的情况下。重要的是, 增加的重现性使它有可能在预筛与样品缓冲系统, 补充了现成的测试蛋白质, 以确定最佳参数之前, 实际的实验进行。这将使样本的消耗量保持在绝对最小值, 并极力推荐。NS 和低温 EM 网格准备的关键步骤是: (一) 泵系统的启动;对于分 nanoliter 体积分配, 系统液体 (水) 必须脱气和气泡自由。(二) 对辉光放电或等离子清洗步骤的精确控制;EM 网格的表面特性对重现结果至关重要。(三) 样本调理;调节所需的时间,例如, 与 NS 有关, 取决于缓冲类型、盐含量和浓度 (图 3), 以及 microcapillary24的喷嘴几何。(iv) 用于定量 em 的 NS em 制剂的蒸发率;咖啡环效应可以禁止对 NS EM 制剂进行定量分析, 并且必须抑制由 DP 阶段控制的慢速蒸发速率。
提出的网格准备方法的不同方面可以自由地结合起来, 允许为特定的样本开发通用的协议。典型的例子是去除一种物质, 防止高分辨率 EM,例如, 甘油, 通过一个调节步骤之前, 网格准备为低温 EM;在制备网格之前, 通过调节来引入介导分子, 如配体;或用 NS 或冷冻 EM 检查单细胞裂解液 (图 6)。
在所提出的方法中使用微流体和最小样本量完全消除了对纸张印迹步骤的需要。这是一个很大的优势, 因为纸印迹是一个苛刻的治疗蛋白质, 可能会污染样品与有害的离子, 并内在导致大量的样本损失。另一方面, 当使用 cryoWriter 时, 在采用经典方法制备低温 EM 试样时, 所形成的薄试样的空气-水界面可能造成的影响。适用于低温 EM 的网格可以在样品应用和玻璃化 (未显示数据) 之间的等待时间内准备好。然而, 当蛋白质在几纳秒内通过扩散传播到纳米的几个第十时, 仍然有足够的时间让它们与 100 nm 厚的样品膜的空气-水界面相撞几次。然而, 这些短时间的间隙可能会显著降低粘附在空气-水界面上的蛋白质的数量, 并可能防止蛋白质变性或限制粒子定向。另一种有希望的方法, 可能保护敏感蛋白的空气-水界面是覆盖样品膜的低分子量表面活性物质。这些化合物可以通过 cryoWriter 的调节步骤在栅格准备前迅速引入。微流控系统的高表面体积比是 cryoWriter 的进一步限制, 因为样品可能会因不特异吸附 microcapillary 表面而丢失, 并通过粒子计数干扰定量分析。问题的解决方式有两个方面: 第一, 样本在 microcapillary 内不会有很长的距离。事实上, 在整个处理过程中, nanoliter 样品体积保持在毛细管尖端。其次, 用 microcapillaries 相对较大的内径,如180 µm, 可进一步降低表面到体积比. 第三, 如果需要, microcapillaries 的表面可以很容易地钝化,例如, 通过处理它们与商用多聚赖氨酸乙醇乙二醇 (PLL 挂钩)。
在 EM 中使用的单粒子方法对蛋白质的高分辨分析只需要10万到数以百万计的单个蛋白质粒子的图像。这意味着微流控技术可以为结构研究提供足够的蛋白质复合物。为快速分离蛋白质复合物 (大约1小时) 从极小的细胞数量 (大约4万个细胞) 被开发了一个小型化免疫沉淀方法28早期。这种方法现在将直接与 cryoWriter 的小型化样品准备阶段相联系。最后的目标是开发一个集成的微流控管道, 用于超快速蛋白质隔离和低温 EM 网格准备, 需要不到两个小时。此外, 如图 6所示, 样品制备所需材料的分钟量和体积, 以及使用 cryoWriter 实现的几乎无损调理和网格制备程序, 使研究蛋白质成为可能。单个细胞的复合物。同时, 小型化免疫沉淀法和 cryoWriter 奠定了一个新的蛋白质组学方法的基础, 称为 "单细胞视觉蛋白质组学", 正如我们最近演示的热休克实验24。目前正在测试用于分析 "视觉蛋白质组" 图像的数据分析算法。

应用透射电子显微镜 (TEM) 对蛋白质络合物进行结构分析的硬件和软件近年来已有大量进展。所做的改进为 "解决革命"1、2和从根本上改变了结构研究铺平了道路。这场革命始于低温电子显微镜 (冷冻 EM)3,4的出现, 允许在接近生理条件下制备生物样品, 同时降低辐射敏感性, 防止样品蒸发在高真空透射电镜5。在接下来的几年里, 渐进的技术进步逐渐增加了决议的可实现。在这些创新中, 应用了场发射炮6、7和最近改进的数据分析算法, 如最大似然法8、9。直接电子探测器摄像头10,11,12,13, 电影模式成像和伴随的软件发展14,15,16,17, 提供了通过单粒子分析实现生物样品原子分辨率所需的最终突破 (回顾一下, Grigorieff,等等。18). 低温 EM 的重要性最近得到诺贝尔化学奖授予三名先驱的承认。
为了用 TEM 对生物样品进行图像处理, 用于加载 EM 网格的方法 (随后称为 "网格准备") 必须确保生成的样本层 (i) 足够薄 (< 100 nm), 以避免非弹性或乘法分散的广泛噪声。电子, (ii) 经得起电子显微镜的高真空, (iii) 保护生物分子免受辐射伤害。两种主要的方法是用来满足这些额外的津贴: 负染色(NS)19,20程序 (图 1A) 吸附样品的薄碳膜, 嵌入的生物分子在无定形的重金属, 然后允许组件在空气中干燥。这是简单和快速的, 加载的 EM 网格 (后来称为 "样本网格") 是容易存储, 可以保存在较长的时间 (一般年份)。透射电镜中, 由于 NS 和耐受的电子剂量比低温制备的高对比度, 但该分辨率仅限于大约20Å. 冷冻 EM 程序 (图 1B) 使用孔碳支持。样品溶液的薄膜横跨孔, 并且 EM 网格被跳入一个制冷剂, 通常液化乙烷, 迅速冷却它在之下150°c。结果是一个无定形, 玻璃化, 50 到100毫微米厚膜的解决方案在支持孔。这种薄薄的无定形薄膜经受了电子显微镜中的高真空, 在理想的情况下, 保存了其原生状态下的生物结构。该程序允许生物样品在高分辨率下成像。然而, 样品网格必须保持在温度低于-150 摄氏度, 以避免 devitrification。它可以成像使用相对较高的电子剂量由于低温, 但对比度和信噪比仍然低。因此, 采用平均技术增加对比度, 如果样品从不同角度进行成像, 则可以重建高分辨率三维 (3D) 地图。目前最常用和最成功的3D 重建方法是采用单粒子方法。最近一次检讨, 见郑在18。
负染色 TEM (NS EM) 是重要的筛选和质量控制, 当需要高对比度或只有有限数量的样品可用 (吸附碳膜一般集中的样品)。如果对蛋白质结构进行高分辨率3D 重构, 单颗粒冷冻 EM 是金本位法。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> 图 1: TEM 网格的原理和经典 (a、B) 和微流控方法 (面板 C、D) 的比较。A)经典的 NS EM 网格准备: 大约3µL 的样品是用手 pipetted 在覆盖着连续碳膜的 EM 网格上 (后来称为 "NS em 网格") (i)。在孵化大约十年代以后, 滤纸被用来将多余的液体从侧面 (ii) 中抹去, 将吸附的生物分子留在薄薄的水膜中。随后, 该蛋白在重金属盐溶液中孵化,如2% 醋酸铀, 二十年代 (iii), 再用过滤纸 (iv) 从侧面印迹去除液体。最后, EM 网格被留在空气中晾干。B)经典的低温 EM 网格准备: 大约3µL 的样品是 pipetted 一只手在孔碳膜上。为了形成薄薄的样品膜, 多余的液体被从一个或两边 (ii) 的纸印迹表面去除。最后, 将网格迅速浸入液态乙烷中进行玻璃化 (iii.)。C)使用 cryoWriter 设置的 NS EM 网格准备: 使用 microcapillary (i) 从样本库存中抽取 5 nL 体积。对于样品调理, microcapillary 尖端浸泡在调节溶液中,如2% 醋酸铵。离子和小分子由扩散交换 (ii)。请注意, microcapillary 的尺寸确保整个过程是扩散驱动的。蛋白质的扩散常数比盐离子低得多, 并没有显著地损失24。最后, 将样品放到网格上, 允许干燥 (iii)。D)采用基于 cryoWriter 方法的低温 em 网格制备原理: 用孔碳膜覆盖的 em 网格放置在温度控制平台的表面上, 并由镊子持有。平台的温度受网格环境露点温度的抵消。网格相对于包含该示例的 microcapillary 移动, 并且 microcapillary 被降低, 直到它是网格上方的几微米。随后, 一些 nanoliters 的样品被免除, 而阶段是移动的螺旋模式;过量液体重新吸气 (i)。在 EM 网格启动后, microcapillary 被撤回, 网格在温度控制平台上保持不变 (随后被称为露点 (DP) 阶段), 以允许受控量的样品蒸发。对于冻结, 网格是迅速从舞台上撤出使用镊子 (ii), 翻转的90°到垂直位置, 并陷入了制冷剂浴 (iii) (后来称为 ' 拾取和暴跌 ' 机制)。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
不幸的是, 用于 NS 和低温 EM 的网格制备方法没有显著改善, 因为它们是发明出来的。目前的缺点是高样品消耗量 (大约3µL 1 毫克/毫升蛋白质) 和大量 (> 99%) 样品丢失 (图 1A, B)。此外, 用于制备低温 EM 网格的经典方法是对蛋白质的苛刻的过程: 首先, 它涉及一个广泛的脸上的纸印迹步骤 (图 1B, ii), 第二, 蛋白质暴露在空气-水界面在相当数量的时间21。本文提出了一种用于 NS em (图 1C) 或冷冻 em (图 1D) 的样品预处理、样品网格制备和后处理 (网格干燥或玻璃化) 的替代方法。内部建立的安装, 称为 "cryoWriter", 使用小型化的样品处理技术和微流控原理, 以吸入, 条件和分配样品, 避免纸印迹完全和提供替代方法, 以薄样品冷冻 EM它大大减少了样本消耗, 并改善了对样品准备的用户控制作为一个整体。此外, 该方法还允许新的实验应用;例如, 在 "单细胞视觉蛋白质组学"22、23、24、25的方法中制备单个细胞的孤立生物成分。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

由于最近的技术进步, 低温电子显微镜 (低温 EM) 正在迅速成为一种标准的方法, 结构分析的蛋白质络合物的原子分辨率。然而, 蛋白质分离技术和样品制备方法仍然是一个瓶颈。一个相对较小的数字 (10万到数亿) 的单个蛋白粒子需要被成像的高分辨率分析蛋白质的单粒子 EM 方法, 使微型样品处理技术和微流控原理可行。
提出了一种小型化、无纸无印迹 em 网格制备方法, 用于采样预处理、EM 网格启动和后处理, 仅消耗 nanoliter 量的样本。该方法采用分 nanoliter 精度的配料系统控制液体吸收和 em 网格启动, 控制网格温度的平台, 从而确定 em 网格上方的相对湿度, 并给出了取样的取跳机构。玻璃。对于低温 em, 将 em 网格置于温度控制阶段, 样品吸入毛细管。毛细管尖端位于网格表面附近, 网格装入样品, 多余的重新吸气进入 microcapillary。随后, 试样膜稳定, 并由控制水蒸发, 由温度相对于露点的偏移调节。在给定的点上触发了拾取和跳起机制, 将引物的 EM 栅格迅速转移到液态乙烷中, 用于样品玻璃化。或者, 可以使用示例调节方法为负着色 (NS) EM 准备 nanoliter 大小的样本卷。
这些方法大大减少了样本消耗, 避免了可能对蛋白质有害的方法, 如传统方法中使用的滤纸印迹。此外, 少量的样本需要允许新的实验策略, 如快速的样本调理, 结合单细胞裂解的 "视觉蛋白质组学" 或 "无损" 总样本的准备, 以定量分析复杂的样本。

为了测试图 1C中提出的小型化 EM 网格准备程序, 开发了 "cryoWriter" 设置 (图 2所示)。图 2A显示了安装在反荧光显微镜下的各种组件的概述。细胞培养模块安装在显微镜的左侧;用于 EM 网格准备的模块位于右侧。细胞培养模块 (图 2B) 允许生长的黏附性真核细胞和细胞培养的活细胞成像的光显微镜。单个细胞通过渗透休克、电穿孔和吸入细胞内容的联合作用裂解到一个 microcapillary (图 2B,图 6a)24,25。吸气裂解样品可以用来为 NS 或冷冻 EM 制备网格。另外, PCR 管中的股票蛋白溶液可以是样品来源。所使用的 microcapillary (图 2B) 连接到高精度泵系统, 允许样本量被吸气, 并免除了亚 nL 精度。正如协议中详细说明的那样, 所有的示例处理都是在这个 microcapillary 或 EM 网格本身中执行的, 没有大量的示例传输。例如, 同一 microcapillary 用于溶解单个真核细胞, 吸入裂解液, 条件, 并最终免除整除数到 EM 网格。网格准备模块由一个可移动的 DP 阶段组成, 它允许放置在其上的 EM 网格的温度精确控制 (图 2C)。对于 NS 透射电镜, 所制备的样品网格可以简单地从冷阶段除去, 并允许在室温下风干。然而, 所谓的咖啡环效应, 然后可能导致需要避免的定量 TEM, 蛋白质 ' 粒子 ' 的计数。要做到这一点, 网格在 DP 阶段缓慢干燥, 使用逐渐增加的温度梯度来减缓液体蒸发。对于低温 EM, 栅格的温度保持在露点附近;选择一个大约8°c 的正偏移量, 允许液体的控制蒸发以实现薄膜的稳定和细化, 如果需要, 可以通过传感器对其进行监测26。在选定的细化时间后, 激活一个拾取和跳过的机制, 样品是玻璃化的 (图 2C)。请注意, 在室温下存储的 NS EM 网格不需要这种暴跌机制。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig2.jpg"> 图 2: cryoWriter 设置的概述。A)安装在逆光显微镜 (1) 上的 cryoWriter 安装概述。B)在面板 a 细胞培养室 (2) 的左侧标明的面积的插入, 用 microcapillary (3) 进行样本操作, 并将细胞裂解置于微型的基于基板的细胞培养板 (4) 之上。C)在面板 A 中的右侧显示的区域的插入. ' 拾取和暴跌 ' 机制。孔碳膜 EM 栅格 (5) 安装在镊子 (6) 的尖端上, 并在与温度控制的阶段 (7) 的直接接触中水平定位, 称为主文本中的露点阶段 (DP 阶段)。舞台温度通过 PID 控制器和水冷的珀尔元件进行严密控制, 使其保持在或接近露点温度, 具体取决于周围环境。DP 阶段 (7) 安装在电动 xy 轴上, 以移动网格相对于 microcapillary。microcapillary 本身安装在 z 级, 并可以降低, 直到它非常接近 EM 网格的表面, 并用于分配 nanoliter 大小的卷上的样本支持覆盖它 (NS EM 的连续薄碳层或孔碳膜为 cr哟 EM)。请注意, 液体摄取和配药是使用高精度泵系统 (8)。分配的液体可以通过移动网格相对于 microcapillary 在螺旋模式。在低温 EM 制备过程中, 选取和跳冷机构 (9) 迅速将试样加载的网格转化为液态乙烷 (10), 用于快速冷却和样品玻璃化。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
图 3显示了使用 cryoWriter 安装程序准备的 NS EM 网格所获得的代表性结果。microcapillary 的尖端从一个股票溶液中装载了5个样品, 并浸入了 ns 溶液 (2% 甲胺钨酸盐) 的油藏几分钟, 允许 ns 和盐离子的扩散交换 (理论讨论见阿诺德, et等。24). 之后, 条件样品被分配到一个 NS EM 网格的薄碳膜和干燥。图 3a显示了使用缝隙网格的方法, 以同样的方式可视化完整的水滴, 根据需要的定量 TEM。为了避免咖啡环效应, 新的辉光放电栅最初举行在露点温度 (没有水蒸发), 然后慢慢地热身在 DP 阶段。注意, 对于大多数应用 (例如, 样品或结构分析的质量控制), 这一缓慢干燥过程是不需要的。在没有它的情况下获得高质量的 NS 准备, 如图 3B C所示。无磷酸盐低盐缓冲器的调理时间约为3分钟,例如, 用低盐三缓冲器 (20 毫米三 HCl pH 7.4 和50毫米氯化钠), 如图 3B所示, 使用烟草花叶病毒 (TMV) 作为样本。图 3C提出了最坏的情况, 因为 TMV 是在 PBS 缓冲 (2.7 毫米氯化钾, 1.5 毫米2PO4, 136.9 毫米氯化钠, 8.9 毫米 Na2HPO4·7H2O, pH 7.4)。磷酸盐离子与 NS 的重金属离子形成瞬态晶体 (见图 5C), 延长了所需的调理时间 (7 分钟)。其他重金属盐也可以与栅格制备模块一起使用,例如, 2% 甲胺钒酸钠或钼铵 (也见阿诺德等。24). 然而, 醋酸铀是不合适的;如果蛋白质样品在溶液中被适应, 在对碳膜的吸附之前 (参见图 5E)23, 这个污点的交联作用导致聚集。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig3.jpg"> 图 3: 使用 cryoWriter 安装程序编写的 NS 网格的典型结果, 如图 1C所示。a)概述在与2% 甲胺钨酸盐进行调理后, 在插槽网格上分配的 3 nL 水滴的图像。B) TMV 20 毫米三缓冲器。该嵌入显示指定区域的3x 放大。改编自阿诺德, et 等人24 (进一步的权限相关的材料摘录应定向到 ACS)。C)烟草马赛克病毒 (TMV) 在 PBS 缓冲器。该嵌入显示指定区域的3x 放大。改编自阿诺德, et 等人24 (进一步的权限相关的材料摘录应定向到 ACS)。刻度条: A, 100 µm;B, 50 毫微米;C, 80 nm。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
图 4描述了使用 cryoWriter 安装程序准备的低温 EM 网格的典型结果。面板4A 显示了玻璃化样品覆盖区域的网格图谱。面板4B 显示了所选网格槽中玻璃冰的同质性。在这两种情况下, 样品是在25毫米 HEPES 的 pH 值 7.5, 50 毫米 NaCl 缓冲含有 0.05% Fos 14 洗涤剂。测试了许多样品和缓冲器, 获得了可媲美的高质量玻璃冰, 但所需的条件是依赖缓冲 (参见图 5的讨论)。面板4C 显示 apoferritin 粒子和噬菌体在三 hcl 缓冲 (20 毫米三 hcl, 50 毫米氯化钠; pH 7.4) 成像在高离焦, 以增加对比度。面板4D 显示了一个由 amphipoles 稳定的 200 kDa 膜蛋白。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig4.jpg"> 图 4: 使用 cryoWriter 安装程序编写的低温 EM 网格的典型结果, 如图 1D所示。示例和缓冲区在显示的示例中有所不同。所有样品都装在孔碳膜上。a)概述图像的拼贴 ("网格图谱") 的样品含有 150 kDa 膜蛋白, 玻璃冰的外围由白色箭头表示。B)用同一个缓冲器制备的网格扩大网格插槽, 显示孔碳膜与玻璃冰。一些孔没有填充示例缓冲区, 如白色箭头所示。C)含 apoferritin 蛋白配合物和噬菌体的陶瓷样品的碳孔。嵌入: 两个扩大显示噬菌体的尾巴。白色星号表示碳膜。请注意, 图像被记录为高离焦, 以增加对比度。D)在 amphipols 中重组 200 kDa 膜蛋白。插入: 显示的区域的2x 扩大增加的对比。刻度条: A, 100 µm;B, 10 µm;C 和 D, 80 nm。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
cryoWriter 设置允许系统地筛选最佳 EM 网格准备条件;例如图 5A (apoferritin 25 毫米 HEPES-KOH pH 7.5, 50 毫米氯化钠, 0.05% Fos 14)。实验中, 玻璃冰的 "细化" 温度变化, 但细化时间 (即试样应用与冻融的时间间隔) 保持恒定 (1 s)。在低偏移温度下 (例如, 8 K), 样品层太厚。在较高的偏移温度下, 孔中的玻璃冰较薄 (10 k, 12 k), 直到某一阶段 (高于 18 k), 网格变得完全干燥 (未显示)。在这里给出的结果, 12 K 的偏移导致一个大均匀面积的玻璃冰, 由黑色箭头表示。这种优化实验可以使用 "测试" 蛋白质 (如 apoferritin) 的目标样本的缓冲进行。找到的最佳条件然后应用于目标样本。此外, 在制备过程中往往能识别出参数不太理想的网格, 无需在电子显微镜中进行筛选, 节省了大量的时间。图 5还显示了典型的低温 em (面板 B) 和 NS em (面板 C 到 E) 特定于 cryoWriter 设置的工件的画廊。TMV 板5B 中显示的低温 EM 网格中含有0.1% 癸基β D-maltopyranoside (2.7 毫米氯化钾、1.5 毫米、2PO4、136.9 毫米氯化钠、8.9 毫米 Na2HPO4·7H2O、pH 7.4、0.1%DM), 过度稀释。由于盐浓度过高, 图像的背景呈颗粒状。一般而言, 样品的视觉外观似乎不是盐浓度的线性函数;当在细化过程中达到阈值浓度时, 晶粒突然变得突出。请注意, 在网格准备之前, 可通过调节步骤删除有害物质, 如协议第1.6 节中所述的 NS EM。NS 可能导致其他工件。在面板5C 显示的例子中, PBS 缓冲器 (2.7 毫米氯化钾, 1.5 毫米2PO4, 136.9 毫米氯化钠, 8.9 毫米 Na2HPO4·7H2O, pH 7.4), 没有样品被条件在2% 甲胺钨酸盐为3分钟. 沉淀和晶体是明显和施加广泛的力量在碳表面导致裂缝。沉淀只在一定的 PBS 和 NS 浓度范围内形成, 可以通过对样品进行更长时间的调节来避免 (比较图 3C)。面板5D 显示了一个配发的 NS 样品滴的外围展示了一个 "咖啡环"。这将扰乱数量, 总样品分析, 可以避免通过减慢干燥过程,即, 通过保持 EM 网格在露点温度在样品应用期间, 然后逐渐增加温度烘干它 (见图 3A)。面板 5E (apoferritin 在20毫米 HEPES, pH 7.0, 条件3分钟) 显示的交联活性的2% 铀酰乙酸盐染色, 这是不能用于条件下的蛋白质样品吸附到碳膜支持。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig5.jpg"> 图 5: 当 cryoWriter 设置用于为 NS 和低温 EM 准备网格时, 观察到系统的变化和工件。A) 系统的玻璃冰厚度变化;低温 EM 网格准备的优化。DP 阶段的偏移温度变化 (8 k 到 12 k) 保持细化时间常数 (1 s)。箭头指示样本层的外围。B)盐效应;高度集中,即细化步骤太长。该插图描述了指定区域的2x 放大。C)由 PBS 缓冲器在重金属盐存在下形成的盐沉淀。包含 PBS 缓冲区的示例的条件必须比其他缓冲区中的示例长。在这里, 没有样品的 PBS 缓冲器被限制在2% 甲胺钨酸盐中3分钟, 这是其他样品缓冲器的典型时间。注意裂纹在碳膜最可能由于强的力量从沉淀作用在稀薄的支持在干燥过程期间。D) ' 咖啡环 ' 效果。E) Apoferritin 条件在2% 的醋酸铀中, 3 分钟铀的离子表现出显著的交联活性, Apoferritin 团形成大团聚体。刻度条: A, 80 µm;B, 80 毫微米 C, 12 µm;D, 80 µm;E, 200 nm。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
使用 cryoWriter 设置进行 EM 网格准备所需的少量和体积, 可以实现新的实验类型。例如, 可以为 NS 和低温 EM 收集和准备单个单元格的总内容。该过程显示在图 6A中。一个黏附, 真核细胞 (HEK 293) 是裂解的同时电穿孔和样品吸入 (面板 6A)25。总容积 3 nL 是吸气, 其中包含细胞裂解, 并保留在 microcapillary 进一步处理。对于面板6B 所示的 NS EM, 细胞培养培养基与 PBS 缓冲器 (2.7 毫米氯化钾、1.5 毫米2PO4、136.9 毫米氯化钠、8.9 毫米 Na2HPO4·7H2O、pH 7.4) 交换细胞裂解前。细胞的内容是吸入 3 nL 的缓冲区和条件在一个 ns 水库, 如图 1C所示, 10 分钟. 之后, 一个5的 nL 体积被配发到 ns EM 网格的连续碳膜上。在图像中可以识别单个蛋白质,如丝状肌动蛋白和附着蛋白的膜贴。对于冷冻 em, 如图6C所示, 在孔碳 em 网格上分配了 3 nL 的体积, 而无需重新吸除液体。在玻璃化前, 所形成的试样厚度较厚的薄膜被广泛稀释。为此, 从露点温度开始, DP 级温度逐渐增加。细化过程由实时传感器系统监视, 直到达到预先指定的阈值, 触发 "拾取和跳" 机制和样品玻璃化 (详情见阿诺德等. 26). 膜结构和蛋白质可以在图像中识别出来。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig6.jpg"> 图 6: 使用 cryoWriter 设置的单细胞视觉蛋白质组学。a)裂解单个粘附真核细胞。细胞生长 (1, 绿色) 在一个功能化, ITO 涂层 (红色) 玻璃滑动 (2) 在一个小型化的培养皿 (3)25。ITO 层是电接地的。细胞由 microcapillary (4) 接触, 上面涂有铂。最初的渗透性休克 (未被指出) 用于促进裂解, 这是由一系列的电脉冲和由在细胞裂解的渴望中施加的剪切力。该过程可通过光镜监测;对显微镜的物镜进行了说明 (5)。有关详细信息, 请参阅我们以前的工作24、25。B)从单个 HEK 293 细胞中的裂解液的 NS EM 图像。丝状肌动蛋白和膜贴附蛋白是可见的。小组改编自阿诺德, et 等.24 (与摘录的材料有关的进一步权限应定向到 ACS)。C)从单个 HEK 293 细胞中的裂解液的低温 EM 图像。该插图显示了一个2x 扩大的指示区域, 其中典型的膜结构与相关的蛋白质是可见的。小组 C 适应了阿诺德, et 等26标尺: B, 50 毫微米;C, 80 nm。<a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig6large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

介绍了一种用于透射电镜制备 nanoliter 大小试样体积的仪器和方法。没有纸印迹步骤是必需的, 从而避免了这可能对蛋白质的有害后果, 大大减少样本损失, 并使分析单细胞裂解的视觉蛋白质组学。

透射电镜的小型化样品制备方法

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.4K 次观看.  University of Basel. 介绍了一种用于透射电镜制备 nanoliter 大小试样体积的仪器和方法。没有纸印迹步骤是必需的, 从而避免了这可能对蛋白质的有害后果, 大大减少样本损失, 并使分析单细胞裂解的视觉蛋白质组学。

视频: Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

电子显微镜对胚胎的制备果蝇胚胎心管

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

科研

生物学

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

单病毒原子力显微镜和超分辨率荧光成像的样品制备

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

串联高压冷冻和植物组织中快速冷冻替代透射电子显微镜

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

该做什么和不该做什么低温电子显微镜的:入门样品制备和高质量的数据采集为大分子三维重建

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

样品制备质谱术分析

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

暴跌冻结:在透射电子显微镜的超微结构和免疫组化研究工具悬架细胞

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

准备厚生物样品的观察扫描透射电子断层扫描

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

透射电镜下体的样品制备与成像

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高压冷冻、微波辅助对比度增强和最小树脂嵌入在体积成像中的生物样品制备

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.