这项工作是由卫生部资助NS-024572（至RSW）美国国家研究院​​的支持。

1，染色制备与体外活体染料<ol><li>对于束带蛇解剖协议见Stewart 等人。5和滕等 6爬虫组织保持生理更长的时间，并且以较少的细菌污染，当在低温下保存（见下文）。哺乳动物组织通常保持在室温或更高。 </li><li>溶酶体活体染料染色，溶解染料在寒冷的爬虫类林格氏液1:5,000（0.2微米）。孵育在4℃下持续15分钟。用冷林格多洗几次。尽快形象。 </li><li>对于FM1-43染色用的KCl刺激，淡化色素在高氯化钾铃声1:500（7微米）。在孵育4℃30-60秒最大。用冷林格快速洗三次，约1分钟/冲洗。尽快形象。 </li><li>为FM1-43染色用高渗（蔗糖）的刺激，淡化色素在如上述的0.5M蔗糖铃声。孵育4＆＃176，C为2-5分钟。用冷水洗涤林格如上面步骤1.3。尽快形象。 </li><li>为FM1-43染色通过电刺激，见滕等 6简要地说，将制剂置于含有生理盐水溶液和染料烹调。神经受到刺激与200微秒矩形脉冲（〜7伏，30赫兹，18微秒）预编程的火车。用冷水洗涤林格如上面步骤1.3。尽快形象。 </li></ol> 2配置准备成像<ol><li>定向制备，使得感兴趣的结构尽可能接近到显微镜物镜。 </li><li>如果倒置显微镜时，利用室，其底部包含了一个薄的圆盖滑。通常，成像室应具有一薄的不锈钢底部用25毫米直径的＃1厚度的玻璃盖玻片在中心。如果一个堂堂正正的显微镜时，不需要底盖玻片，但很有用允许成像透射光（ 如微分干涉相衬，DIC）的定向标本，并找到感兴趣的对象。 </li><li>选择一个合适的目标，以获得尽可能高的3D解决。有折衷的数值孔径（NA），工作距离，放大，和类型的镜头中（干燥的，水和油浸渍）。对于薄筹备样组织文化，石油的目标是最好的。使用直立显微镜，漂浮在水浴盖玻片，并用盖玻片的顶部和物镜之间的浸油。 </li><li>如果反卷积软件使用时，供应商可能对某些目标提供预定的点扩散函数（点扩展函数）。如果没有这样的信息提供，或者如果不支持的客观选择，通过荧光成像网点或类似的衍射极限的物体7,8确定的PSF。 </li></ol> 3，建立场所需的深度和IMA数GES每定时帧期望<ol><li>选择场的总深度，使移动或相互作用的利益结构不消失或不能聚焦，因为他们移动在z方向。在z域应该略微超过该细胞或细胞过程被成像的垂直尺寸。对于脊椎动物电机端子，15-20微米是典型的。 </li><li>计算所需的聚焦的每个增量z轴的步骤。沿z轴的分辨率的变化取决于目标的属性;它是在xy平面上的分辨率的四分之一左右。如果任共焦成像，或解卷积软件被使用时，沿z轴的分辨率得到了改善。提高最终解决方案通过在z方向5深思熟虑过采样，可以参看下面的步骤3.3。一个典型的步进间隔，取值范围从400-1,500 nm的40-100X的目标。灯应每个z步图像之间关门了。 </li><li>选择每个Z-堆栈的图像的数量，即场的所希望的深度除以通过该步骤的时间间隔。的时间来完成的典型的Z-堆栈是1-10秒。快速移动的物体（100纳米/秒）可以出现模糊的3D图像堆栈，因为每个图像平面对应一个稍微不同的时间点。此外，每个额外的图像有助于漂白和光毒性可能（见讨论）。如果上述任何一种情况涉及，选择较大的z步，收集每个堆叠较少的图像。利用图像插值软件（下面的步骤6.3）后补偿。 </li></ol> 4，选择定时帧速率选择通过实验的速度是刚刚足够的顺利解决随时间的变化，如运动，相互作用或融合事件9。根据抽样可以产生运动伪影（抽样误差），而过采样增加不必要的曝光。收集一个单长序列或来自同一制剂中，每个具有相对小的总的时间间隔（几重复序列<eM&gt;例如：10个时间点×30秒的时间间隔= 5分钟）。如果可能的话，请查看准备连续落射荧光照明粗略估计运动速度，包括整个筹备漂移（如果存在）。 5，完成所有实时成像为一个特定的准备爬虫类制剂通常保持强劲的〜1-2小时，更长，如果冷却。 6，分析数据根据所需用途<ol><li>保留所有的原始数据文件。虽然数字存储通常不是一个问题，处理时间更快速的个人计算机或工作站显著。出于这个原因，裁剪图像到感兴趣[ROI]的区域。确保感兴趣的整个区域是在裁剪窗口的整个时间过程中。 </li><li>去卷积图像叠加使用适当的软件和正确的点扩散函数。确认该决议得到改善，并没有神器已经由生成卷积算法。 图3显示了示例图像。 </li><li>使用插值算法，扩大z轴明显的分辨率。 6X的扩张从实际1.5微米图像平面分离到一个明显的0.25微米分离建议。另外，使用过采样的某种组合（步骤3.2）和内插。 </li><li>如果需要进行对比度，亮度，噪声过滤，漂白和其他典型的图像处理的调整。图像处理标准规定，对大多数的科学工作，适当的是相同的修正应用于所有的图像，无论是在一个叠层，并在不同的时间点。一个特定的调整的结果应该所有图片9中进行评估。 </li><li>选择一个特定的显示模式下进行数据的导出。最简单的显示器是使用任一红-绿或红-蓝的anaglyphs（ 图3中的例子），立体声对，或交替的立体视频的左/右击与快门眼镜吨眼帧。的anaglyphs被限制为单一色。如果需要的话，改善Z轴视觉分辨率提高表观图像的深度。 </li><li>尝试各种不同的滤波和图像增强技术。例如，拉普拉斯滤波是有用的，以增加上述背景小的结构的对比。在一个运行的窗口的中心像素的亮度被提高，而周围区域的亮度被降低。请注意，一些过滤方法没有在组合很好地工作。 </li><li>适用漂移校正，如果有该制剂随时间的显着运动。这样的运动是生活中常见的肌肉，即使添加的药物来抑制动作电位和突触电位。像素配准算法（ 例如 ，IMARIS，Adobe后遗症，TurboReg插件ImageJ的）对齐时间推移图像，并能降低，但通常不能完全消除，这种运动。 </li></ol>

<ol>
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作者宣称没有竞争的财务权益。

四维成像的最重要方面是光线照射的持续时间和强度的管理。光漂白减小图像信号与噪声的比，并且可以是有问题的或不依赖于多种因素，包括选择的荧光团。到生物体组织（光毒性）的非特异性损伤有关，光漂白，并且有时可以使用为目的而设计2,12或通过检查形态与合适的明场光学，如微分干涉对比（DIC）的荧光探针来识别。 这是可能的，但是，以诱导发生在光?...

活体组织的时间推移成像提供可视化访问动力学结构与功能的关系，不能在成像在单个时间点固定或生活准备将不胜感激。然而，通常的折衷访问的时间信息是在光学分辨率的降低。高数值孔径的油浸目标是因为它们的窄的范围内聚焦的不切实际的活组织，留下水浸泡或干的目标是唯一的选择。此外，通过共聚焦光学系统所带来的增加的分辨率不能被使用在一些生活制剂因光毒性的相对较高水平照明的所需1,2。最后，虽然几个实时或延时的光学技术是可用的提供增强的分辨率，其适用性是有限的制剂，其中感兴趣的结构可以被定位在目标1的几百纳米。中记载的方法使得使用相对低成本的设备，具有通用性，还提供了改进的分辨率相比，更常用的时移技术。它的目的是用于个人实验室以及成像设施。 该方法利用常规落射荧光显微镜，结合一个灵敏的数字照相机和与硬件设计来快速地获得图像集在稍微不同的焦平面（Z-堆栈）。每个z-堆栈数字去卷积，以提高分辨率。三维时间推移（4D）成像的一个特点是移动的细胞器或其他结构的精确跟踪。当正确设置，成像结构不出去的焦点，并在所有三个方向的运动可以观察和量化。因而这是不可能的染色后的结构消失在一个或多个时移的帧仅通过漂流的上方或下方的窄焦平面。该方法也可作为一个敏感的工具，以评估的相互作用和可能的复锡永的小结构。常规落射荧光或接近衍射极限（几百纳米）的结构的共焦图象不确认融合即使合并的图像显示，它们各自的标签3的重叠。融合建议，但它仍然是可能的目的是通过一个距离，该距离低于衍射极限水平或垂直方向分隔开。三或四维成像，相反，允许观看在三个正交方向上的对象。融合在所有三个视图的外观增加了确定性的水平。而且，在一些生活的准备，指挥或推定融合对象的布朗运动提供了进一步的证据时，这两个标签一起移动的时间。当然，当接近衍射极限的确定性在从背景拘泥的结构，或表明它们含有两种染料（融合）的水平，也不是绝对的。如果适用的话，专门技术，如荧光共振能量转移（FRET）4，是比较合适的。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGC5</td>
			<td>Biotium [Hayward, CA]</td>
			<td>70057</td>
			<td>Final conc:10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>F35335</td>
			<td>Final conc:7 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Final conc:0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2.5&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High KCL Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>&#160;86&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>&#160;60&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High Sucrose Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2. 5 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>0.5 M (17.1 gm/50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Axioplan 200 inverted microscope</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm&#160;</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher</td>
			<td>Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td>175W Xenon arc lamp</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Lambda 10-2&#160; emission filterwheel switcher</td>
			<td colspan="2">Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensicam CCD camera</td>
			<td colspan="2">Cooke Instruments [Tonawanda, NY]</td>
			<td><a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cascade 512 CCD camera</td>
			<td colspan="2">Photometrics [Tucson, AZ]</td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slidebook 5.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO]</td>
			<td>Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMARIS 7.5.2</td>
			<td>Bitplane [South Windsor, CT]</td>
			<td>Drift correction; 3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AfterEffects CS6</td>
			<td>Adobe [San Jose, CA]</td>
			<td>Drift correction</td>
			<td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.46</td>
			<td>National Institutes of Health [Bethesda, MD]</td>
			<td>Multiple plugins available;Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM</td>
			<td>Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td>Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endosome dynamics in living nerve terminals with four-dimensional fluorescence imaging

四维（4D）光成像已被用于薄的横运动神经末梢内学习的小结构腹行为的袜带蛇的肌肉。原始数据包括3D Z-堆栈延时序列。每个堆栈包含在由400-1,500 nm的分离焦平面收购与萤光光学4-20图像。在采集图像栈，如调整聚焦的步骤，切换激发波长，并在数码相机的操作，是自动的，尽可能最大化图像率和最小化从光照射的组织损伤。采集后，一组图像栈的去卷积，以提高空间分辨率，转化成所需的3D格式，并用于创建4D“电影”，是适合各种基于计算机的分析，这取决于所寻求的实验数据。一个应用是两个阶级内涵体的神经末梢，macroendosomes发现（MES）的动态行为的研究和酸性核内体（AES），其大小（200-800纳米的两种类型）是在或接近衍射极限。获得在每个时间点的三维信息提供了几个优点优于常规延时成像。特别是，规模和结构的运动速度可以一次进行量化比没有的大家关注的焦点损失。从四维成像数据的例子揭示的ME接近质膜和消失，这表明它们是胞吐而不是简单的垂直移动远离焦点的单个平面上。还透露，是公认的融合的ME和AE的，如通过在三个正交投影观看两个含染料结构之间的重叠可视化。

所示的数据是从蛇神经肌肉端子（参见低和高放大视图在图3中，内吞染料（FM1-43）的吸收产生的雾度，填补各布顿）和，尤其是macroendosomes（MES）和酸性核内体（AES）在这些端子5。 ME的由大容量的内吞作用的神经活动10时创建的，其数量随时间呈指数下降后的活动已经停止6。利用四维实时成像是确定的ME走向质膜和迅速消失，这表明他们的号码，因为他们中?...

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Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

四维（4D）成像被用于研究中两种类型的核内体的活的脊椎动物神经终端的行为和交互作用。这些小的结构的运动的特征是在三维空间中，从而允许确认如内涵体融合和胞吐作用的事件。

内吞体动力学在生活神经末梢与四维荧光成像可视化

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

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8.9K 次观看.  Washington University School of Medicine. 四维（4D）成像被用于研究中两种类型的核内体的活的脊椎动物神经终端的行为和交互作用。这些小的结构的运动的特征是在三维空间中，从而允许确认如内涵体融合和胞吐作用的事件。 