扩展轴突转运体内成像工具包

使用我们的方案，我们可以可视化和定量评估来自活体麻醉小鼠的运动和感觉神经元的轴突内切体内体和线粒体的信号传导的动态。该方法可用于了解体内轴突的基础生理学，揭示疾病小鼠模型中驱动周围神经变性的重要病理机制。我们的技术可用于评估潜在治疗（如药理剂和基因疗法）对活运动和感觉神经元轴突转运的影响。

该技术可用于同时对特定周围神经轴突中的不同细胞器进行成像，并传递运动疾病模型和衰老的研究。通过拉动分级玻璃微量移液管开始准备，以便在较小的肌肉中进行最佳的肌内注射。对于手术，将无菌手术悬垂物固定在设置为37摄氏度的热垫上，并将手术显微镜定位并聚焦。

然后，按照手稿中所述打开所有必需的手术工具和器械。当准备完成后，将麻醉的小鼠转移到位于手术空间单独区域的吹嘴上，并确保角膜和踏板退出反射不存在，然后再将毛皮从手术区域剃掉。然后，使用手术胶带的粘性一面从鼠标中取出剃光的毛皮。

接下来，将鼠标放在体重秤上以记录术前的重量。然后，使用棉签涂抹眼部润滑剂，并将鼠标和吹嘴转移到手术区域。要注射胫骨前肌或TA肌肉，请将鼠标放在背部，并从中线向外伸展后肢。

当后肢处于正确位置时，在脚上放置手术胶带。使用70%乙醇或等效溶液对剃须区域进行灭菌。将破伤风，神经毒素或HcT溶液的工作毒性片段吸入拉出的玻璃微量移液管中。

接下来，在与运动和板区域相对应的区域的感兴趣肌肉上做一个小切口。然后。刺穿肌肉上的外部筋膜以注射HcT.将微量移液器保持在适当的位置5至10秒，然后慢慢退出。

注射后，用一到两针缝合切口。然后，将鼠标转移到隔离的恢复笼中观察30分钟。准备通过在手术区域周围布置手术工具和器械来暴露坐骨神经。

通过将石蜡膜切割成一个宽一厘米的窄矩形，并带有倾斜的尖端来帮助成像过程，从而创建楔块。准备完成后，将鼠标转移到手术区域的烟嘴上，并使用手术胶带将头部固定在烟嘴上。用手术胶带将目标后肢从中线向45度延伸并固定。

如果角膜和踏板抽出反射消失，则使用剪刀切开坐骨神经上方的皮肤。然后，去除覆盖的股二头肌和肌肉组织或结缔组织，而不会损伤坐骨神经和血管。当完整的坐骨神经充分暴露时，将预先加热的无菌盐水涂抹在坐骨神经周围的区域以防止干燥。

然后，使用弯曲的镊子破坏深部结缔组织，并将预先准备好的石蜡膜楔块置于神经下方。将盐水浸泡的棉絮放在暴露的区域，然后将鼠标移动到热垫顶部的充满异氟醚和氧气的感应室中。对于成像，将22×64毫米的盖板玻璃放在定制的显微镜载物台上，并用胶带固定盖板玻璃的位置。

将浸油涂到物镜上后，将显微镜载物台连接到倒置显微镜，然后慢慢抬起油浸式物镜以接触盖板玻璃。设置准备就绪后，使用胶带将麻醉吹嘴固定在显微镜载物台上。然后，从坐骨神经中取出棉絮，并将鼠标从感应室转移到暴露的神经面向盖板玻璃的吹嘴。

将小鼠的头部固定在烟嘴上，并在保持最低足够麻醉水平的同时，轻轻抬起鼠标尾巴，将无菌盐水添加到暴露的坐骨神经附近的盖玻片上。在眼球的帮助下，定位坐骨神经以确定最佳焦点，并选择含有运动轴突细胞器的感兴趣区域。接下来，通过单击"采集"按钮并选择感兴趣的区域切换到计算机软件。

使用数字变焦获得 80 倍的放大倍率，并旋转所选区域以水平显示轴突 单击"区域"框并选择感兴趣的矩形区域。在采集模式下，将帧大小设置为最小 1024 x 1024 像素，并开始 100 到 1， 000 帧的延时采集。每只小鼠从三个轴突中捕获至少10个运动货物。

在这项研究中，使用转基因小鼠实现了体内运动轴突特异性标记。从活的麻醉ChAT中观察到胆碱能运动轴突中增强的绿色荧光蛋白或eGFP表达。鼠标。

使用替代方法，tdTomato在ChAT中新切除的神经中表达。tdTomato小鼠无需额外的组织处理即可获得。此外，通过注射示踪剂或标志物（例如编码eGFP的HcT或腺病毒）到骨骼肌中来鉴定轴突。

代表性分析展示了一个延时图像系列，该序列代表了HB9的活运动神经元中信号内体的体内轴突转运。通用防空导弹。GFP在HB9中具有更精细的模式。

通用防空火索。水户的育种。使用化学疗法的氟化酶小鼠。

tdTomato小鼠能够在运动轴突中可视化线粒体。此外，还可以识别兰维尔节点。将HcT注射到水户的肌肉中。

CFP小鼠允许在体内同时可视化相同轴突内的信号内体和线粒体。观察到顺行和逆行移动的细胞器，以及停滞的细胞器。在成像过程中减少麻醉是有利的，因为它可以限制大呼吸伪影的影响，从而简化轴突转运的跟踪和分析。

坐骨神经可以指导RNA和蛋白质分析，将细胞器动力学与轴突运输机制的关键组成部分（如运动蛋白和货物特异性适配器）相关联。