我们非常感谢博士罗伯特·S·Kerbel（多伦多大学，新宁研究所，加拿大多伦多，加拿大）的技术帮助和专业知识在此过程中发展的实验室。我们还要感谢桑德拉·塞克斯顿博士和罗斯威尔公园癌症研究所部实验动物资源。这项工作是从罗斯威尔公园联盟基金会（以JMLE）裁决的支持。

1。原位肾肿瘤植入<ol><li>细胞培养<ol><li>在此之前原位移植，种植鼠标RENCA LUC细胞单层至75％汇合。 </li><li>以下胰​​蛋白酶消化并重新悬浮于含5％FBS的培养基，离心分离细胞，以1,000 rpm，4℃，5分钟，重复3次，在PBS中洗涤。然后悬浮细胞在无血清培养基，以5×10 4 RENCA LUC / 5μL无血清培养基中的浓度。 注：根据不同的变种或使用细胞系，细胞可以以1:1的比例基质胶和无血清培养基的放缓植入后高攻击小鼠细胞的生长和传播的再悬浮。 </li></ol></li><li>手术和细胞移植 注：其中所描述的所有动物的研究，包括实验终点的维护和决心，根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）P分别进行rotocol批准罗斯威尔公园癌症研究所。 <ol><li>麻醉用异氟醚（2-3％）1 BALB / c小鼠。捏脚和检查反射，以确保有足够的麻醉。适用于兽医软膏的眼睛，以防止干燥。将鼠标右侧卧，刮胡子前和后肢之间左侧。用酒精和碘酒沿背腰部区域为无菌切口准备区。 </li><li>用手术剪启动1厘米的皮肤切口，在最后肋和髋关节之间的纵向方向。使用钝性分离剪刀皮肤下松开结缔组织。用手术剪，以0.5厘米的切口在长度方向上在腹壁。用弯钳轻轻向下推周围开放性伤口 - 这将exteriorize肾和注射前允许器官的温柔固定。 </li><li>加载汉密尔顿注射器5μL准备好的细胞混合物。对于子囊IMPLANtations，2注入的方法可以采用： <ol><li>浅表性：与斜面边缘向上平行延伸到肾囊下的纵定向肾，插入针（但薄壁段）。一旦针到位，注入所有的细胞，直到白色小泡的形式。慢慢地从胶囊取出针头，并立即涂抹在注射用无菌棉签吸收任何泄漏和防止细胞传播。 </li><li>内部：与斜面边缘并从肾脏相反的一侧开始到最后的植入位置，通过肾脏的内部插入针直至针是可见的（但不打孔）亚荚膜空间。注入的所有单元格，直到白色泡沫形式和拭注射部位，以防止任何泄漏。 </li></ol></li><li>轻轻肾脏返回到体腔中。关闭用5-0可吸收缝线薇乔腹部体壁。一旦完成，拉扯皮肤层一起放置2-3胜OUND剪辑。确保剪辑是坚定和间隔均匀，以确保没有创面暴露。在回收前施用500微升0.9％的NaCl和100μl丁丙诺啡（0.01毫克/毫升）的皮下用25号针头。定期监测夹子安置和稳定，并在10天后删除。 </li></ol></li></ol> 2，肾切除术/原发肿瘤去除<ol><li>遵循相同的协议，用于鼠标麻醉，固定，切口，肾暴露在章节1.2.1和1.2.2（前述）。 </li><li>使用第二对镊子轻轻除去从尾端连接的脂肪组织和来自肾脏的颅端肾上腺分离肾脏。同时轻轻抓住肾脏，用5-0可吸收缝线薇乔使输尿管周围一个双结，肾动脉，静脉。上面结慢慢的安全，然后切成取出肾脏。如果马上失血，或有任何迹象是保持足够的风险在缝合输尿管，动脉，静脉的，然后用cauterizer，而不是剪刀剪下上面结。 </li><li>一旦肾脏被删除，请仔细检查是否有出血的动脉栓并在必要时使用cauterizer。关闭用5-0薇乔腹部体壁。拉扯皮肤层一起放置2-3伤口剪辑如1.2.4中所述的相同的注意事项。每日密切监视动物手术后痛苦的迹象，出血或活动受限。按照动物的组织指导方针安全。 </li></ol> 3，监测转移进程和本地化的端点<ol><li>转移性疾病定量：发光法监测<ol><li>看到以前在JOVE描述监测转移使用的细胞转染荧光素酶和利用精诺真IVIS成像系统11,12量化方法。 </li></ol></li><li>视觉剖检指南转移性分布的比较评估化<ol><li>根据使用的端点，包括窘迫征象，呼吸困难，体重减轻等机构的指导方针牺牲动物 注：密切监测动物是至关重要的，因为自发的转移进程可以是充满变数和快速。 </li><li>用手术剪刀开始一直延续了胸腔，以下颌尿道口上方的切口。用钝端剪刀将皮肤从腹壁的肌肉分开。 </li><li>开始沿手臂和腿部切口。剥离的皮肤了。仔细检查皮肤筋膜和腹壁的结节，那么，浅表淋巴结肿大：腹股沟，臂丛，腋和颈浅。 </li><li>做一个切口在腹腔壁和沿到膜片上的左，右的侧面切割。有一个横向切去除腹壁的前部裸露的内脏。 </li><li>检查内脏f的外观原状或极显着的肿瘤。还要注意胃和肠道中的内容;如果它们是空的，鼠标可能不会已经能够吃。如果内容是黑暗的，这可能表明上/下消化道出血的证据。 </li><li>目测评分各器官肿瘤的存在或不存在下，分配一个总的分数，各小鼠组（每组4只动物被用作例如，在图1D-ⅰ）。 注释：1）淋巴结肿大并不一定意味着它是一个肿瘤生长;如果是很大的规模，很结实，发白的颜色，它可能是一个转移灶。 2）过度乳白色或混浊的液体在腹部指示腹水。腹水可能包括固体堆积在腹部脏器，特别是肝脏和胃的叶之间。 3）对器官如肺，多发性结节可以存在并计数为动物个体之间的比较（参见第13为例）。 </li><li>通过小心地从一个喷瓶取出并用PBS肝，脾，肾和胰腺：确定总的肿瘤个体腹部器官或异常。 </li><li>去除腹部器官后，检查腹腔淋巴结，包括腰，骶，肾和肠系膜淋巴结。 </li><li>评估隔膜的转移扩散的证据。 注：在膜片广泛的传播可能会导致它失去收缩能力，导致或吃力呼吸损失。 </li><li>去掉膜片，使两个横向切口于胸腔，除去前面的部分，以暴露肺和心脏。 </li><li>轻轻抓住并提起食道和切割高于心脏气管取出的肺和心脏。评估组织的结节。挤压心脏。缺乏弹性的一致性可能预示肿瘤的存在。 </li><li>用手术剪透过颅骨线性切割。轻轻地取出小块头盖骨，直到t他整个大脑被暴露。看看整个大脑可见结节或异常变色。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics.">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li><li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma.">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li><li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models.">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li><li>Steeg, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Drug+Development+Must+Consider+the+Impact+on+Metastasis.">Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis.</a> Clin. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis.">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li><li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+cell+carcinoma:+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences.">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li></ol>

作者什么都没有透露。

此协议的目的是使用同基因肿瘤小鼠模型来描述植入/切除技术来评估临床相关的自发转移性疾病。目前，大多数临床前研究，评估新的实验疗法不包括转移性疾病的研究中，只有少数概括的原发肿瘤生长，手术切除，并最终自发转移扩散的阶段。迄今为止，基因工程小鼠模型（GEMMS）产生的诱发自发性肾细胞疾病进展（见14摘要）不包括后期转移和外科干预策略迄今尚未见报道。因此，自...

死亡的患者的肾细胞癌（RCC）的主要的原因是，通常发生在手术切除原发肿瘤在肾生长的全身性转移疾病。然而，很少有临床前肿瘤模型评价实验治疗的小鼠包括转移性疾病，少仍然忠实地复述局部增长，手术和自发微转移的发生和发展1-3的临床分期。在测试这个差距，已成为新的治疗方法，因为有时出现在动物模型中引人注目的抗肿瘤作用并不总是翻译成同样成功治疗的患者4的评价越来越重要。在结果这种差异可能源于局部的异位或原位原发性肿瘤模型和晚期转移性疾病的5-7之间的差的药物疗效。在碾压的情况下，只有少数研究采用建立了nimal协议，其中包括自发复发的疾病，谁通常有荷瘤肾脏模仿患者全部或部分除去2,3。在小鼠模型中测试这种情况的原因缺乏变化。首先，有高动物成本和肿瘤细胞的选择和转移潜能的固有可变性。例如，人肾细胞系往往很少转移，并且必须在多个回合的主原位植入和转移性选择派生的变种，始终传播并形成远处病灶进行选择（见这样的人细胞系的推导8-10的说明） 。相反，小鼠细胞免疫功能的模型往往表现积极，低细胞数量必须与基质胶，以减少直接的全身播散3注入。其次，在执行适当的植入，手术切除（切除术），和跟踪技术困难（和量化）自发metastati℃生长可以是具有挑战性和几个关键变量采用这种技术时（见讨论的细节）需要考虑。本协议的目的是描述原位移植，切除（切除术），并监测自发转移性肾细胞癌的疾病的基本步骤（以及潜在的缺陷），并提供一个指引，规范（以及更广泛的）科学实验室中使用该评估实​​验治疗的疗效。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">FBS</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">1x DPBS without Calcium &#38; Magnesium</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Matrigel</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td>must be kept on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Artifical tears-lubricant opthalmic ointment</td>
			<td style="width:147px;">Akorn Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">17478-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Pocket pro pet trimmer</td>
			<td style="width:147px;">Braintree scientific</td>
			<td style="width:119px;">CLP9931B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:397px;">Alcohol swab</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Betadine solution swab</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">67618-152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25mm blades - 4.5&#34;&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Southpointe surgical</td>
			<td style="width:119px;">RS-5982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Iris Forceps, serrated, curved, 10cm long</td>
			<td style="width:147px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS15915</td>
			<td>need two of these</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">10&#181;l Hamilton syringe</td>
			<td style="width:147px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">30G, 45 degree, RN needle</td>
			<td style="width:147px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7803-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:397px;">Sterile cotton tipped appicator</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10805-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">High temperature cautery kit</td>
			<td style="width:147px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS500392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">J834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Reflex clip applier for 7mm clips</td>
			<td style="width:147px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS500343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Reflex clips, 7mm, non-sterile</td>
			<td style="width:147px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS500344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Removing forceps, 12cm lone</td>
			<td style="width:147px;">Kent scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS500347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">0.9% Sodium Chloride</td>
			<td style="width:147px;">Baxter Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">2B1322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">Buprenorphine 0.01mg/mL</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">25G 5/8&#34; needle</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">1mL syringe w/out needle</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:397px;">D-Luciferin</td>
			<td style="width:147px;">Gold Bio technology</td>
			<td style="width:119px;">LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mrcc) in mice following nephrectomy

其中一个关键的挑战，新的实验治疗肾细胞癌（RCC）提高了测试的模型，忠实地复述早期和晚期转移性疾病进展的发展。典型肿瘤植入模型利用异位或原位原发性肿瘤植入，但很少有全身性的自发转移性疾病，模仿临床上。本协议描述的关键步骤，制定农村信用社疾病进展阶段类似患者。首先，它采用了高转移性小鼠肿瘤细胞系中的同源模型，以显示原位肿瘤细胞植入。方法包括浅表和内部植入与细胞基底膜结合，防止漏电和早期传播子荚膜空间。接着，它描述了程序的荷瘤肾（肾切除术）切除术，具有重要的前和手术后的小鼠护理。最后，它概述了监测和评估的必要步骤微观和宏观转移性疾病的进展，包括生物发光成像，以及提供详细的视觉剖检指南进球全身性疾病的分布。此协议的描述的目的是为了便于普遍使用的临床相关的转移性肾细胞癌模型，以提高未来的治疗试验的预测值。

图1A显示的原理，概述在本协议中总结的详细步骤。有几个重要的因素必须考虑每一步。例如，在步骤1中也示出了两种方法用于子囊肿瘤细胞植入到肾。肿瘤细胞可以被注入到子荚膜空间与一个白色的小泡，确认细胞的渗漏防止通过小心去除针和抽汲过量逸出流体（ 图1B-ⅰ）的局部位置。为了防止泄漏，细胞可植入内部先到达子荚膜空间（ 图1B-ii）中，并?...

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Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma mRCC in Mice Following Nephrectomy

可用于临床相关设置评估治疗自发性转移性肾细胞癌（RCC）疾病进展的模型。该协议显示不同的程序原位肾肿瘤细胞植入，适当性肾切除术，最后概述了视觉和生物发光的负担转移和本地化得分尸检指南。

在小鼠模型自发转移性肾细胞癌（MRCC）肾切除

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

modeling-spontaneous-metastatic-renal-cell-carcinoma-mrcc-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

16.4K 次观看.  Roswell Park Cancer Institute. 可用于临床相关设置评估治疗自发性转移性肾细胞癌（RCC）疾病进展的模型。该协议显示不同的程序原位肾肿瘤细胞植入，适当性肾切除术，最后概述了视觉和生物发光的负担转移和本地化得分尸检指南。 